论文部分内容阅读
背景及目的:骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种与关节软骨细胞凋亡和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解相关的慢性疼痛致残性疾病。近年发现,软骨细胞自噬的缺失在OA进展中起关键作用。自噬是细胞在应激条件下降解细胞内成分循环利用,维持必需的细胞功能的适应性反应。雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)是一种新型大环内酯类免疫抑制剂,可以抑制mTOR信号通路的mTORC1,从而激活自噬。已有研究表明自噬对OA软骨细胞有保护作用。目前研究自噬对软骨细胞凋亡的影响鲜有报道。本研究应用体外培养软骨细胞方法,探讨地塞米松(dexamethasone,DEX)诱导软骨细胞凋亡的可能损伤机制,并通过RAPA激活软骨细胞自噬,研究自噬在DEX诱导软骨细胞凋亡中的影响,以期为OA的预防和治疗提供新依据。方法:从5位股骨颈骨折需行髋关节置换术患者和7位实施全膝关节置换术晚期OA患者的关节软骨中分别分离培养获得正常和OA软骨细胞。将成功培养的第二代软骨细胞分为以下6组,正常软骨细胞加BSA至终浓度为100ug/ml培养12h;正常软骨DEX组细胞加DEX-BSA至终浓度为100ug/ml培养12h;正常软骨RAPA组细胞加RAPA至终浓度为1mmol/L培养2小时,再加DEX-BSA至终浓度为100ug/ml培养12h;OA软骨细胞加BSA至终浓度为100ug/ml培养12h;OA软骨DEX组细胞加DEX-BSA至终浓度为100ug/ml培养12h;OA软骨RAPA组细胞加RAPA至终浓度为1mmol/L培养2小时,再加DEX-BSA至终浓度为100ug/ml培养12h。MTT法检测细胞活性,LC3自噬双标腺病毒检测软骨细胞自噬体数量,Western-Blot检测自噬的总LC3B、LC3B-II、ULK1、Beclin1蛋白表达,定量RT-PCR检测细胞ULK1、Beclin1、LC3、TNF-α和IL-1的mRNA表达,ELISA法检测细胞中IL-1、TNF-α蛋白浓度,流式细胞术及TUNEL法检测软骨细胞凋亡。结果:MTT法检测显示,无论正常或OA软骨细胞,与BSA组相比,DEX-BSA组存活率均降低(P<0.001);与DEX-BSA组相比,RAPA+DEX-BSA组存活率均升高(P<0.001)。LC3自噬双标腺病毒检测细胞自噬体荧光分光光度分析显示,OA软骨细胞中,DEX-BSA组比BSA组下降(P<0.01);RAPA+DEX-BSA组均比DEX-BSA组在正常(P<0.05)和OA软骨细胞(P<0.001)中升高。Western-Blot检测显示,无论正常或OA软骨,与DEX-BSA组相比,RAPA+DEX-BSA组总LC3B(P<0.001)、LC3B-II(P<0.001)和ULK1(P<0.001)蛋白表达均升高;RAPA+DEX-BSA组Beclin1蛋白表达比DEX-BSA组在正常软骨细胞中(P<0.001)、OA软骨细胞中(P<0.01)升高。OA软骨细胞中,与BSA组蛋白表达相比,DEX-BSA组ULK1(P<0.01)、Beclin1(P<0.001)和总LC3B(P<0.001)、LC3B-II(P<0.001)均下降。正常软骨细胞中,与BSA组蛋白表达相比,DEX-BSA组ULK1(P<0.001)、Beclin1(P<0.001)、LC3B-II(P<0.001)和总LC3B(P<0.01)表达均下降。定量RT-PCR检测显示,正常软骨细胞中,与BSA组相比,DEX-BSA组基因表达Beclin1(P<0.001)、LC3(P<0.01)和ULK1(P<0.001)均下降。OA软骨细胞中,与BSA组相比,DEX-BSA组基因表达Beclin1(P<0.001)、ULK1(P<0.01)和LC3(P<0.01)均下降。无论正常或OA软骨细胞,与BSA组相比,DEX-BSA组TNF-α和IL-1基因表达均升高(P<0.01)。正常软骨细胞中,与DEX-BSA组相比,RAPA+DEX-BSA组LC3(P<0.05)、Beclin1(P<0.001)和ULK1(P<0.001)基因表达均升高,TNF-α(P<0.01)和IL-1(P<0.05)基因表达下降。OA软骨细胞中,与DEX-BSA组相比,RAPA+DEX-BSA组ULK1(P<0.01)和LC3(P<0.05)基因表达升高,Beclin1基因表达无差异(P=0.09),TNF-α和IL-1的表达均下降(P<0.01)。ELISA法检测显示,与BSA组相比,DEX-BSA组的TNF-α和IL-1蛋白浓度,在正常软骨细胞(P<0.001)、OA软骨细胞(P<0.01)中均升高。无论正常或OA软骨细胞,与DEX-BSA相比,RAPA+DEX-BSA组TNF-α(P<0.001)和IL-1(P<0.01)均下降。流式细胞术检测显示,无论正常或OA软骨细胞,与BSA组细胞相比,DEX-BSA组均见凋亡率增加(P<0.001)。RAPA+DEX-BSA组细胞凋亡率比DEX-BSA组在正常软骨(P<0.01)和OA软骨细胞(P<0.001)中降低。TUNEL法检测显示,OA软骨细胞中,与BSA组细胞相比,DEX-BSA组凋亡小体形成增多,荧光分光光度升高(P<0.05)。正常软骨细胞中,与BSA组细胞相比,DEX-BSA组凋亡小体形成增多,但荧光分光光度升高不显著(P=0.19)。结论:DEX能够降低软骨细胞存活率及增加凋亡率,导致软骨细胞破坏并参与OA的发病,其机制可能与提高炎症介质TNF-α和IL-1的表达和下调细胞的自噬有关。RAPA能够增强软骨细胞自噬,减少软骨细胞TNF-α和IL-1的表达以及抑制细胞凋亡途径进而增强细胞活性,减轻或缓解DEX对软骨细胞的损伤,对DEX诱导的细胞凋亡具有软骨保护作用。