目的:癌症是当今世界威胁人类生命的主要疾病,其中肺癌以其发病率和死亡率高、预后差,成为癌症中最受关注的对象之一。肺癌形成的分子机制十分复杂,但氧化应激是肺癌发生中普遍公认的重要机制之一。NFE2L2和NFE2L1同属于CNC-bZIP家族的具有碱性赖氨酸拉链结构的转录因子,在抵御氧化应激,维持机体氧化还原稳态中发挥重要作用。大量研究显示NFE2L2具有预防与氧化应激相关的疾病,抑制肿瘤的发生等优势,但癌症细胞会利用NFE2L2的优势来协助癌细胞生长、转移、扩散等,即NFE2L2在肿瘤发生和发展中具有双重作用。此外,与NFE2L2相比,NFE2L1可能具有更强的生理和病理作用,因此NFE2L1可能是癌症防治中更为重要的靶点,但仍存大量研究空白。本研究利用肺泡Ⅱ型上皮（Alveolar type Ⅱ epithelial,ATⅡ）细胞的特异性启动子肺表面活性蛋白C（Surfactant protein C,Sftpc/SP-C）来构建Nfe2l1和Nfe2l2肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除的小鼠（Nfe2l1（ATⅡ）-KO及Nfe2l2（ATⅡ）-KO）,研究NFE2L1和NFE2L2在乌拉坦（Urethane,Ure）所致的小鼠肺腺癌发生中的作用,并初步探索可能的机制。研究方法:1.Nfe2l1（ATⅡ）-KO和Nfe2l2（ATⅡ）-KO小鼠的构建:采用C57BL/6遗传背景的小鼠构建Nfe2l1-KI/Sftpc-rtTA^+/-/Teto-Cre^+/-和Nfe2l2-KI/Sftpc-rtTA^+/-/Teto-Cre^+/-三重转基因小鼠,通过基因型鉴定,将Nfe2l1-KI、Nfe2l1-KI/Sftpc-rtTA^+/-、Nfe2l1-KI/Teto-Cre^+/-、Nfe2l1-KI/Sftpc-rtTA^+/-/Teto-Cre^+/-、Nfe2l2-KI、Nfe2l2-KI/Sftpc-rtTA^+/-、Nfe2l2-KI/Teto-Cre^+/-、Nfe2l2-KI/Sftpc-rtTA^+/-/Teto-Cre^+/-及Sftpc-rtTA^+/-/Teto-Cre^+/-几种基因型的小鼠在6周龄时给予含有2 mg/mL强力霉素（doxycycline,DOX）,5%蔗糖的饮用水,饮水2周。2.小鼠原代ATⅡ细胞的提取与鉴定:应用Dispase Ⅱ消化法制备小鼠肺组织单细胞悬液,采用免疫磁珠分选法从小鼠肺组织分选Lin^-/Ep-CAM⁺细胞,经过48 h培养后,贴壁细胞即为小鼠原代ATⅡ细胞,通过倒置显微镜观察贴壁细胞形态,并采用免疫荧光法鉴定小鼠原代ATⅡ细胞特异表达标志物SP-C的表达。3.Nfe2l1（ATⅡ）-KO和Nfe2l2（ATⅡ）-KO小鼠特异性敲除效果鉴定:提取Nfe2l1（ATⅡ）-KO、Nfe2l2（ATⅡ）-KO及其KI对照组小鼠的原代ATⅡ细胞,用实时定量聚合酶链式反应（Quantative polymerase chain reaction,qPCR）检测各组小鼠原代ATⅡ细胞中Nfe2l1和Nfe2l2的mRNA表达量,以判断Nfe2l1（ATⅡ）-KO和Nfe2l2（ATⅡ）-KO小鼠Nfe2l1和Nfe2l2的敲除效果。ATⅡ细胞分选过程中所得Ep-CAM^-细胞用作敲除效果阴性对照。4.Ure致小鼠肺腺癌模型构建:预实验采用C57BL/6遗传背景的野生型小鼠,用Ure以1 g/kg的剂量进行腹腔注射,每周1次,连续10周,在注射结束后10周进行观察;正式试验将Nfe2l1（ATⅡ）-KO和Nfe2l2（ATⅡ）-KO各种基因型小鼠随机分配到注射Ure的实验组和注射生理盐水的对照组,Ure以1 g/kg的剂量进行腹腔注射,每周1次,连续10周,在注射结束后17周进行观察。5.Ure致小鼠肺腺癌的评价与鉴定:收取小鼠时通过计数肺表面肿瘤个数,测量肺表面肿瘤直径,计算肺表面肿瘤体积及平均直径,测量肺脏重量等来评估肿瘤负荷;肺组织包埋切片,HE染色评价肺肿瘤病理类别,免疫组化检测SP-C以鉴定肺腺癌细胞来源,免疫组化检测PCNA及TTF1以鉴定肺腺癌。6.小鼠ATⅡ细胞MLE-12 Nfe2l1基因沉默与鉴定:用携带靶向Nfe2l1 shRNA的慢病毒（Nfe2l1-KD）与非靶标阴性对照慢病毒（Scramble,Scr）转染MLE-12细胞,用0.5μg/m L嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞,通过检测MLE-12细胞Nfe2l1的mRNA及蛋白表达水平来鉴定沉默效果。7.转录组测序（RNA-Sequence,RNA-Seq）及信息分析:Nfe2l1（ATⅡ）-KO及Nfe2l1-KI小鼠原代ATⅡ细胞,Scr及Nfe2l1-KD MLE-12细胞,收取后于Trizol保存,由广州基迪奥公司进行mRNA建库、测序,通过Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）对差异基因表达分析和功能进行富集分析。以qPCR对测序所得目标RNA进行验证。8.统计分析:本研究所有数据均使用GraphPad Prism 5软件进行数据分析。结果:1.成功构建Nfe2l1（ATⅡ）-KO和Nfe2l2（ATⅡ）-KO小鼠:免疫磁珠分选法提取小鼠原代ATⅡ细胞,细胞呈圆形并呈铺路石样生长,且ATⅡ细胞特异性标志物SP-C阳性染色,即成功提取小鼠原代ATⅡ细胞。Nfe2l1（ATⅡ）-KO组较Nfe2l1-KI组小鼠原代ATⅡ细胞中的Nfe2l1表达量明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,阴性对照细胞Nfe2l1表达无变化;Nfe2l2（ATⅡ）-KO组较Nfe2l2-KI组小鼠ATⅡ原代细胞中的Nfe2l2表达量明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,阴性对照细胞Nfe2l2表达无变化。2.成功构建Ure致野生型小鼠肺腺癌模型:采用连续给药的方式进行造模,实验终点时,在小鼠肺表面观察到乳白色瘤体,切片HE染色后可观察到上皮样增生、腺瘤样增生、以及腺瘤几种典型的肺腺癌病灶。3.Nfe2l2（ATⅡ）-KO不影响Ure所致小鼠肺腺癌易感性:采用连续给药的方式对Nfe2l2（ATⅡ）-KO小鼠进行肺腺癌造模,实验终点时观察Nfe2l2-KI组小鼠与Nfe2l2（ATⅡ）-KO组小鼠的患病情况无明显差别,通过肿瘤负荷评估（肺表面的结节数量,结节负担,平均肿瘤直径）依旧无明显差异。4.Nfe2l1（ATⅡ）-KO小鼠对Ure所致肺腺癌易感性升高:采用连续给药的方式对Nfe2l1（ATⅡ）-KO小鼠进行肺腺癌造模,实验终点时可明显观察到无论雄性还是雌性,与Cre和Nfe2l1-KI组小鼠相比Nfe2l1（ATⅡ）-KO组小鼠的患病情况更重。通过肿瘤负荷评估发现,Ure注射组Nfe2l1（ATⅡ）-KO小鼠的肺组织重量明显重于同组的Nfe2l1-KI小鼠且差异具有统计学意义（P<0.05）;Nfe2l1（ATⅡ）-KO小鼠的肺表面肿瘤个数明显多于同组的Nfe2l1-KI小鼠且差异具有统计学意义（P<0.05）;Nfe2l1（ATⅡ）-KO小鼠的肺表面肿瘤体积明显大于同组的Nfe2l1-KI小鼠且差异具有统计学意义（P<0.05）;但Nfe2l1（ATⅡ）-KO小鼠的肺表面肿瘤平均直径与同组的Nfe2l1-KI小鼠相比并未发现明显的差异。此外,切片HE染色发现,相比于Nfe2l1-KI小鼠的瘤组织,Nfe2l1（ATⅡ）-KO小鼠的肺肿瘤部分更多,通过定量分析Nfe2l1（ATⅡ）-KO小鼠的肿瘤面积更多且差异具有统计学意义（P<0.05）。对肺组织切片进行免疫组化染色发现肿瘤组织部位表达SP-C、PCNA和TTF1,通过定量分析发现与Nfe2l1-KI组相比Nfe2l1（ATⅡ）-KO组的SP-C、PCNA和TTF1阳染细胞所占面积更多,并且差异具有统计学意义（P<0.05）。5.Nfe2l1敲除或沉默对ATⅡ细胞RNA表达的影响:RNA-Seq结果显示,与Nfe2l1-KI组相比,Nfe2l1（ATⅡ）-KO组ATⅡ细胞上调基因669个,下调基因406个;相比于Scr组,Nfe2l1沉默MLE-12细胞上调基因657个,下调基因220个。Nfe2l1抑制后,原代ATⅡ细胞和MLE-12小鼠ATⅡ细胞系在细胞因子-受体互作、粘附力、蛋白降解、细胞周期、细胞基质-受体互作和PI3K-Akt几个共性信号通路上发生变化。qPCR对代表性基因进行验证,其变化趋势与RNA测序结果一致。结论:1.成功构建Nfe2l1（ATⅡ）-KO和Nfe2l2（ATⅡ）-KO小鼠。2.肺泡Ⅱ型上皮细胞中NFE2L1在乌拉坦所致的小鼠肺腺癌中发挥肿瘤抑制作用。