第一部分 Cis-MPs和LDI联合治疗诱导的抗肿瘤T细胞免疫依赖于巨噬细胞目的:肿瘤细胞来源的微颗粒(Tumor cell-derived microparticles,T-MPs)能够运送化疗药物,增强其杀伤肿瘤能力,降低副作用。包裹药物的T-MPs对肿瘤的杀伤作用是否可以通过其他手段加强还不清楚。放射治疗是典型的有副作用的癌症治疗常规方法,低剂量放射(Low Dose Irradiation,LDI)在癌症治疗中比在常规放射治疗的方案更有效。本研究通过联合包顺铂微颗粒(Cisplatin-packagingT-MPs,Cis-MPs)与LDI,探究联合治疗对肿瘤的治疗效果,和联合治疗所介导的的抗肿瘤免疫的类型,以及巨噬细胞在联合治疗中发挥的作用。方法:(1)为了比较LDI、Cis-MPs及两者联合后的治疗效果,分别用H22肝癌细胞、CT-26结肠癌细胞和Lewis肺癌细胞接种小鼠,观察小鼠肿瘤的生长情况。(2)用裸鼠和CD3、CD4、CD8T细胞清除抗体、巨噬细胞清除剂的手段研究联合治疗介导的抗肿瘤免疫的类型。(3)使用流式细胞术分析巨噬细胞清除后脾脏和肿瘤组织中CD3+ T细胞的数量,并分析脾细胞和肿瘤浸润淋巴细胞中IFN-γ的表达;并使用流式细胞术分析LDI对肿瘤组织中巨噬细胞表型的影响。(4)监测放射后小鼠的体重变化和生存期,以了解放射剂量对小鼠的影响。(5)观察小鼠的生存期以及用肌酐和谷丙转氨酶检测试剂盒检测血清肌酐和谷丙转氨酶的水平,以了解联合治疗对荷瘤小鼠的影响。结果:(1)联合治疗相对单一治疗更加抑制肿瘤的生长,产生更好的肿瘤治疗效果。(2)T细胞缺陷的裸鼠联合治疗疗效消失;T细胞清除抗体CD3、CD4和CD8的使用以及巨噬细胞的清除使Cis-MPs和LDI的联合治疗失去了抗肿瘤作用。(3)巨噬细胞的清除导致较少的CD3+T细胞被募集到肿瘤,脾细胞以及肿瘤浸润淋巴细胞中IFN--γ的表达下调。LDI对肿瘤微环境中巨噬细胞的表型没有影响。(4)小鼠的体重和生存率都不受低剂量放射的影响。(5)联合治疗处理不同模型荷瘤小鼠,提高了小鼠的生存率,对血清肌酐和谷丙转氨酶水平没有影响。结论:联合治疗相对单一治疗对H22、CT26和Lewis皮下瘤有更好的肿瘤治疗效果,Cis-MPs和LDI的抗肿瘤作用需要T细胞介导,而Cis-MPs和LDI联合治疗诱导的抗肿瘤T细胞免疫依赖于巨噬细胞。LDI不影响对肿瘤微环境中巨噬细胞的表型,Cis-MPs和LDI的联合治疗可能使用间接的方式来作用于巨噬细胞。LDI不影响荷瘤小鼠的生存率,Cis-MPs和LDI联合治疗可以提高荷瘤小鼠的生存率而不影响肝肾功能。第二部分TRCs在促肿瘤相关巨噬细胞的极化中起重要作用目的:干细胞样肿瘤再生细胞(TRCs)在建立肿瘤免疫抑制微环境中具有关键作用。然而,缺乏通过破坏TRCs来增强抗肿瘤免疫的手段。我们之前的研究表明,T-MPs通过传递抗肿瘤药物进入TRCs的细胞核而优先破坏TRCs。在这里,我们探究LDI能否增强Cis-MPs对TRCs的影响,并进一步研究TRCs对Cis-MPs和LDI的抗肿瘤T细胞免疫所依赖的巨噬细胞的影响。方法:(1)用顺铂(Cisplatin,Cis)处理 H22、CT26、Lewis 细胞系,用 Cis-MPs联合LDI处理H22细胞系,采用细胞增殖与活性检测CCK-8法检测肿瘤细胞的抑制率和存活率。(2)用Cis-MPs处理H22、CT26、Lewis细胞系,用不同浓度的Cis-MPs、不同的放射剂量联合Cis-MPs、以及Cis、MPs、Cis-MPs单独或联合LDI处理H22肝癌细胞,采用流式细胞术分析肿瘤细胞的凋亡。(3)用Cis-MPs、LDI单独或联合处理原代H22肿瘤细胞或H22、CT-26、Lewis细胞系。采用三维软纤维蛋白基质胶分离筛选TRCs,观察克隆的生长情况。(4)采用三维软纤维蛋白基质胶(3D Fibrin)分离筛选H22、CT-26和Lewis TRCs。用Doxo、Doxo-MPs或Doxo-MPs联合LDI分别处理。通过流式细胞术分析TRCs对药物的摄取;通过流式细胞术分析H22 TRCs药物的外流。(5)用TRCs或普通肿瘤细胞来源的上清液培养巨噬细胞,通过流式细胞术分析巨噬细胞表面分子的表达,然后使用Real-time PCR检测这些巨噬细胞中iNOS、CD86和精氨酸酶1 mRNA的表达水平。(6)用TRCs或普通肿瘤细胞来源的上清液培养巨噬细胞,将野生型鼠脾脏中分离的T细胞分别与这些巨噬细胞共培养。通过CFSE染色法检测T细胞的增殖。(7)用TRCs或普通肿瘤细胞来源的上清液培养巨噬细胞,将这些巨噬细胞分别注射到肿瘤组织,通过流式细胞术检测肿瘤组织中MDSCs和Treg细胞的数量。(8)用TRCs或普通肿瘤细胞来源的上清液培养巨噬细胞,B16-F10细胞分别与上述巨噬细胞共培养,然后将肿瘤细胞皮下或静脉注射到小鼠体内,测量并计算小鼠皮下瘤体积以及肺上的黑色素瘤结节数目。(9)尾静脉注射PKH67(绿色)标记的微颗粒单独或联合LDI处理H22肝癌皮下瘤小鼠,对肿瘤组织进行冰冻切片,通过荧光显微镜观察肿瘤组织对微颗粒的摄取,并通过流式细胞术分析PKH67阳性细胞。结果:(1)顺铂能抑制H22、CT26、Lewis细胞的增殖,Cis-MPs联合LDI处理降低了 H22细胞系的存活率。(2)Cis-MPs处理H22、CT26、Lewis细胞,促进细胞的凋亡。随着Cis-MPs的浓度、放射剂量的上升,肿瘤细胞凋亡增加;联合Cis-MPs以及2×2 Gy处理肿瘤细胞,促进肿瘤细胞的凋亡。(3)用Cis-MPs、LDI联合处理后,体内或体外来源的TRCs克隆生长受到抑制。(4)用Doxo-MPs联合LDI处理的H22、CT-26和LewisTRCs,对药物的摄取增多;而H22TRCs的药物外流减少。(5)TRCs诱导的巨噬细胞表达更高的M2型巨噬细胞表面标志如CD26和精氨酸酶1。(6)TRCs诱导的巨噬细胞抑制T细胞活化和增殖。(7)肿瘤组织中MDSCs和Treg细胞的数量显著增加。(8)TRCs诱导的巨噬细胞能明显的促进皮下黑色素瘤生长和肺转移。(9)LDI不影响肿瘤组织对包药微颗粒的摄取。结论:Cis-MPs联合LDI进一步处理体内和体外来源的TRCs,可抑制TRCs的生长;而用Doxo-MPs联合LDI处理的TRCs,药物摄取增多和外流减少,说明包药微颗粒和LDI联合作用可以较好的抑制肿瘤微环境中TRCs的生长。TRCs诱导的巨噬细胞表达更高的M2型巨噬细胞表面标志以及显著的促瘤作用,说明TRCs对肿瘤相关巨噬细胞极化成M2型起重要作用。第三部分Cis-MPs和LDI联合治疗通过杀伤肿瘤再生细胞重新极化巨噬细胞目的:通过体内实验探讨TRCs与巨噬细胞极化的直接关系。并进一步研究Cis-MPs和LDI联合治疗通过杀伤肿瘤再生细胞对巨噬细胞重新极化的影响,以及巨噬细胞重新极化对肿瘤微环境的影响。方法:(1)用Cis-MPs、LDI单独或联合处理H22肝癌皮下瘤小鼠,通过流式细胞术分析肿瘤组织和脾脏中Ml型、M2型巨噬细胞的数量和CD3+ T细胞的数量以及脾细胞和肿瘤浸润淋巴细胞中IFN-γ的表达;并使用Elisa试剂盒检测IFN-γ的水平。(2)Cis-MPs和LDI联合处理H22肝癌皮下瘤小鼠后,向小鼠的肿瘤组织内再接种H22 TRCs或普通H22细胞,观察小鼠肿瘤的生长情况;通过流式细胞术分析肿瘤组织和脾脏中M1型、M2型巨噬细胞和CD3+ T细胞的数量以及脾细胞和肿瘤浸润淋巴细胞中IFN-y的表达;并使用Elisa试剂盒检测IFN-y的水平。(3)Cis-MPs联合LDI处理H22肝癌皮下瘤小鼠,并联合或不联合氯膦酸二钠脂质体清除巨噬细胞,通过流式细胞术检测脾脏和骨髓中MDSCs和Treg细胞的数量。(4)使用Elisa试剂盒检测肿瘤裂解物和血清中VEGF、GM-CSF、RANTES 和 TARC 的水平。结果:(1)联合治疗相对单一治疗,肿瘤组织和脾脏中M1型巨噬细胞、CD3+T细胞、IFN-γ+CD8T细胞数量增多,而M2型巨噬细胞数量减少;肿瘤浸润淋巴细胞和脾细胞的IFN-γ水平升高。(2)再接种的H22TRCs促进肿瘤的生长;肿瘤组织和脾脏中M1型巨噬细胞、CD3+T细胞、IFN-γ+ CD8T细胞数量减少,而M2型巨噬细胞数量增多;肿瘤浸润淋巴细胞和脾细胞的IFN-y水平降低。(3)联合氯膦酸二钠脂质体清除巨噬细胞,粒细胞型MDSCs(CD11b+Ly-6G+)以及Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+)显著减少。(4)肿瘤裂解物和血清中VEGF、GM-CSF和RANTES水平升高,而TARC水平降低。结论:TRCs是在体内极化巨噬细胞的主要因素,Cis-MPs和LDI联合治疗通过破坏TRCs来减少它们对巨噬细胞的恶性教育,达到治疗性的将促肿瘤相关巨噬细胞(M2)重新极化为抑肿瘤相关巨噬细胞(M1),并通过这种重新极化减少免疫抑制细胞和增加T细胞浸润来重塑肿瘤微环境,导致有效的抗肿瘤T细胞免疫。通过体内实验探讨TRCs与巨噬细胞极化的直接关系。并进一步研究Cis-MPs和LDI联合治疗通过杀伤肿瘤再生细胞对巨噬细胞重新极化的影响,以及巨噬细胞重新极化对肿瘤微环境的影响。