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目的本课题通过甘草降低栀子肝肾毒性的实验研究明确甘草与栀子配伍能够降低栀子的肝肾毒性,通过栀子与甘草不同配伍比例对栀子苷溶出率的影响以及NLRP3通路探讨甘草降低栀子肝毒性的作用机制,最后初步明确甘草降低栀子肝毒性的物质基础。方法1.采用不同配伍比例的栀子甘草对正常SD大鼠和黄疸模型SD大鼠进行研究,单栀子、栀子与甘草配伍1:1、2:1、3:1,连续给药一周后取血进行肝肾功能检测:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)和病理解剖检测,明确甘草与栀子配伍能够降低栀子的肝肾毒性。2.采用超高效液相色谱法(UPLC)测定单栀子、栀子与甘草1:1、2:1、3:1配伍后栀子苷溶出率的变化。色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100 mm,1.7μm);流动相A为乙腈,B为超纯水,乙腈:水(5-95),流速为0.200ml/min,柱温32.3℃,检测波长为238nm,进样体积为0.5μl,明确甘草与栀子配伍后对栀子苷溶出率的影响。3.基于NLRP3通路探讨甘草降低栀子肝肾毒性的机制研究,单栀子、栀子与甘草配伍1:1、2:1、3:1,连续给药一周后取血检测:白介素18(IL-18)、白介素1β(IL-1β),采用RT-PCR法及Western blotting法检测肝组织中NLRP3、Caspase-1、Pro-IL-18、Pro-IL-1βmRNA和蛋白的表达,探讨甘草降低栀子肝毒性的作用机制。4.采用京尼平与甘草成分甘草酸、甘草次酸、甘草苷、异甘草苷不同配伍比例1:1、1:2、2:1对HepG2细胞上清液丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的影响,初步明确甘草降低栀子肝毒性的物质基础。结果1.与空白组相比,模型组肝指标ALT(P<0.01)、AST(P<0.05)、TBIL(P<0.05)均显著升高;与空白组相比,单栀组肝指标ALT(P<0.05)、AST(P<0.05)、TBIL(P<0.01)均显著升高。与单栀组相比,栀子:甘草(1:1)组肝指标ALT(P<0.05)、AST(P<0.05)、TBIL(P<0.01)均显著降低;栀子:甘草(2:1)组肝指标ALT(P<0.05)、AST(P<0.05)、TBIL(P<0.01)显著降低。与模栀组相比,M栀子:甘草(1:1)组肝指标ALT(P<0.05)、AST(P<0.01)、TBIL(P<0.01)均显著降低;与模栀组相比,M栀子:甘草(2:1)组肝指标ALT(P<0.05)、AST(P<0.05)、TBIL(P<0.01)显著降低。与空白组相比,模型组肾指标BUN(P<0.05)、CREA(P<0.01)显著升高。与空白组相比,单栀组肾指标BUN(P<0.01)、CREA(P<0.01)显著升高。与单栀组比较,栀子:甘草(1:1)组肾指标BUN(P<0.05)、CREA(P<0.05)显著降低;与单栀组比较,栀子:甘草(2:1)组肾指标BUN(P<0.05)显著降低。与模栀组比,M栀子:甘草(1:1)组肾指标BUN(P<0.01)、CREA(P<0.01)显著降低,与模栀组比,M栀子:甘草(2:1)组肾指标BUN(P<0.01)、CREA(P<0.01)显著降低。2.线性范围为0.0023-0.0138μg(r=0.9998)此范围内峰面积呈良好线性关系,平均回收率为102.71%,相对标准偏差为3.62%。测得栀子组栀子苷平均含量为0.1979%,栀子-甘草(1:1)配伍组栀子苷的平均含量为0.1306%,栀子-甘草(2:1)配伍组栀子苷的平均含量为0.1358%,栀子-甘草(3:1)配伍组栀子苷的平均含量为0.1601%。3.与空白组比较,模型组IL-18(P<0.01)、IL-1β(P<0.01)指标显著升高,单栀组IL-18(P<0.05)、IL-1β(P<0.01)指标显著升高。与单栀组比较,栀子:甘草(1:1)组IL-18(P<0.05)、IL-1β(P<0.01)指标显著降低;栀子:甘草(2:1)组IL-1β(P<0.05)指标显著降低。与模栀组比较,M栀子:甘草(1:1)组IL-18(P<0.01)、IL-1β(P<0.01)指标显著降低。RT-PCR结果显示,与空白组比较,单栀组NLRP3(P<0.01)、Caspase-1(P<0.01)、Pro-IL-18(P<0.01)、Pro-IL-1β(P<0.01)mRNA表达显著升高;与单栀组比较,栀子:甘草1:1组NLRP3(P<0.01)、Caspase-1(P<0.05)、Pro-IL-18(P<0.05)、Pro-IL-1β(P<0.01)mRNA表达明显下调,栀子:甘草2:1组NLRP3(P<0.01)、Caspase-1(P<0.01)、Pro-IL-1β(P<0.01)mRNA表达明显下调,栀子:甘草3:1组Pro-IL-1β(P<0.05)mRNA表达明显下调;与模栀组比较,M栀子:甘草1:1组NLRP3(P<0.01)、Caspase-1(P<0.05)、Pro-IL-18(P<0.05)、Pro-IL-1β(P<0.05)mRNA表达明显下调,M栀子:甘草2:1组NLRP3(P<0.01)、Caspase-1(P<0.01)mRNA表达明显下调,M栀子:甘草3:1组NLRP3(P<0.05)、Caspase-1(P<0.01)mRNA表达明显下调。Western blotting结果显示,与空白组比较,单栀组NLRP3(P<0.01)、Caspase-1(P<0.05)、Pro-IL-18(P<0.01)、Pro-IL-1β(P<0.01)蛋白表达显著升高。与单栀组比较,栀子:甘草1:1组NLRP3(P<0.01)、Pro-IL-18(P<0.01)、Pro-IL-1β(P<0.01)蛋白表达水平均明显下调,栀子:甘草2:1组NLRP3(P<0.05)、Caspase-1(P<0.01)、Pro-IL-18(P<0.05)、Pro-IL-1β(P<0.05)蛋白表达水平均明显下调。与模栀组比较,M栀子:甘草1:1组Caspase-1(P<0.05)、Pro-IL-18(P<0.01)、Pro-IL-1β(P<0.01)蛋白表达水平明显下调,M栀子:甘草2:1组NLRP3(P<0.01)、Caspase-1(P<0.01)、Pro-IL-18(P<0.05)、Pro-IL-1β(P<0.05)蛋白表达水平明显下调,M栀子:甘草3:1组Caspase-1(P<0.01)、Pro-IL-18(P<0.05)蛋白表达水平明下调。4.与空白组相比,京尼平组ALT(P<0.05)、AST(P<0.01)指标显著升高。与京尼平组相比,京尼平:甘草酸(1:1)ALT(P<0.05)、AST(P<0.05)指标显著降低,京尼平:甘草酸(1:2)ALT(P<0.01)、AST(P<0.05)指标显著降低;京尼平:甘草次酸(1:1)ALT(P<0.01)、AST(P<0.05)指标显著降低;京尼平:甘草次酸(1:2)ALT(P<0.01)、AST(P<0.01)指标显著降低;京尼平:甘草苷(1:2)ALT(P<0.05)指标显著降低;京尼平:异甘草苷(1:2)ALT(P<0.01)指标显著降低。结论1.由栀子甘草配伍对正常大鼠和黄疸模型大鼠肝肾功能影响及病理切片结果分析表明甘草与栀子不同比例配伍之后,能够不同程度的降低栀子的肝肾毒性,且1:1配伍比例最佳。2.甘草降低栀子肝毒性的机制主要与甘草能降低栀子苷的溶出有关;且甘草降低栀子肝毒性机制与NLRP3通路介导有关3.甘草对栀子配伍减毒的物质基础研究中发现:甘草的四种不同成分与京尼平配伍会不同程度降低京尼平的毒性,初步推测甘草解栀子肝毒性的物质基础是甘草酸和甘草次酸。