河弧菌(Vibrio fluvialis)是一种在河流、沿海水体环境中常见的嗜盐性肠道致病菌,在人群易引起散发性和流行性腹泻及各种肠道外感染,也可使水产养殖动物患病,造成严重的经济损失。河弧菌的生化表型特征和霍乱弧菌及气单孢菌相似。目前虽然已经鉴定出一些相关毒力因子,但是它的致病和环境生存机制仍有待深入探究。VI型分泌系统(T6SS)是革兰氏阴性细菌中新发现的分泌系统,通过接触依赖的方式把效应蛋白注射到靶细胞内,从而达到杀伤靶细胞的目的,在细菌的环境竞争性生存中发挥重要作用。河弧菌有T6SS1和T6SS2两套T6SS编码基因簇,其中T6SS2具有功能性的表达,介导河弧菌的菌间杀伤能力。密度感应系统(QS)是细菌通过感知其自身或周围环境中其他细菌的密度变化从而分泌不同的信号分子来调控基因表达的通信系统,参与细菌多种生理过程,包括毒力和致病性的调控。前期工作中,我们研究了温度、盐浓度、渗透压、细菌生长密度等环境因素对河弧菌T6SS2功能性表达的影响,本研究中我们进一步探讨了 QS对T6SS2的调节机制。河弧菌有两套QS系统:以酰基高丝氨酸内酯(AHL)为信号分子的Vfll-VflR系统以及以霍乱自我诱导子1(Cholerae autoinducer 1,CAI-1)和自我诱导子2(autoinducer 2,AI-2)为信号分子的CqsA/luxS-vflS系统,其中vflI为AHL合成酶的编码基因,cqsA为CAI-1信号分子的合成酶基因,luxS为AI-2信号分子的合成酶基因,CAI-1和AI-2的信号传递共用如下下游通路基因:luxU,luxO和vflS。我们的研究发现河弧菌的两套QS系统均参与对T6SS2的调节作用,CAI-1和AI-2通过VflS激活T6SS2的表达和功能:VflI-VflR系统通过VflR正性调控T6SS2的表达。VflS和VlfR均在转录水平正向调节T6SS2核心基因簇和3个独立的hcp-vgrG效应子基因簇的表达。具体说来,我们以野生型河弧菌85003为出发菌株,构建了 cqsA,luxU,luxO,luxS和vflS基因的缺失株,收集了这些缺失株和野生株85003在1%Nacl,30℃和OD600=1.5条件下的沉淀和上清的蛋白样品进行Westerm Blotting分析。我们发现,与野生株相比,△vfS缺失株中Hcp蛋白的表达和分泌量显著降低,而△luxO和△luxU突变株中Hcp蛋白的表达和分泌增多,其中△luxO缺失中升高更显著,说明vfS为Hcp的表达和分泌所必需,而luxO和luxfU对Hcp表达具有下调作用。与Western Blotting检测结果相符,△vfS缺失中hcpmRNA水平显著降低,但△luxO中hcp mRNA较野生株仅有轻微的上调。由于有报道LuxO在高细胞密度时失活,我们进而分析了不同低细胞密度(OD600 0.2,0.5,1.0)条件下WT、△luxO和△luxU中Hcp的表达和分泌水平,结果发现在低细胞密度时△luxO中Hcp蛋白和mRNA水平均显著升高,说明LuxO是在低细胞密度条件下负性调控Hcp的表达,该调节作用可能随着细胞密度的增加而逐渐减弱。VflS是CqsA/LuxS系统通路中的终端调控子,LuxO和LuxU抑制Hcp的表达可能是通过影响VflS的水平实现的,为此我们通过导入生物发光质粒PBB1,检测了 WT、AluxO和△luxU中VflS的表达情况。PBB1只有在VflS表达的情况下才能发出冷光,所以根据冷光的强弱可以判断VflS表达量的强弱。我们的结果表明,VflS表达量的强弱顺序为:△luxO△luxU>WT>△vflS,与这些菌株中Hcp蛋白表达和分泌的水平一致。另外,在△luxO缺失株背景下缺失vflS基因构建的双缺失株△luxOAvflS完全丧失了 Hcp的表达和分泌,进一步说明LuxO是通过调控vflS基因的表达调节T6SS2的活性,由于Hcp在vflS缺失菌株中的表达显著降低,说明VflS是CqsA/LuxS密度感应系统调控T6SS2的主要的正性调控子。在确定VflS是cqsA/luxS系统对T6SS2的主要调控子之后,为了进一步确定VflS的调控作用是否发生在转录水平,我们构建了 T6SS2核心基因簇以及hcpA,hcpB和hcpC(为蛋白Hcp的三个编码基因)的启动子区域与PBBRlux的重组报告载体,分别测定它们在野生株以及△vflS缺失株中的冷光值。结果表明,在野生菌株中核心基因簇和三个hcp启动子的重组报告质粒的冷光值远远大于△vflS缺失株中的冷光值,说明VflS调节T6SS2核心基因簇和三个hcp-vgrG基因簇的转录活性。生物信息学分析在核心基因簇和hcpA,hcpB的启动子区发现存在和霍乱弧菌调控子HapR相似的结合位点,为了确定VflS调控子和启动子区的直接结合作用,我们表达纯化了 VflS的蛋白质,以及PCR扩增和纯化了hcpA和hcpB的启动子区序列,进行EMSA实验。实验发现,随着VflS蛋白浓度的增加,hcpA和hcpB探针的阻滞效应呈现VflS蛋白质剂量依赖性方式,说明VflS蛋白可能直接结合hcpA和hcpB的启动子区发挥表达调节作用。同时,我们探索了 AHL系统对T6SS2的调节作用。通过构建缺失株AvflI和AvflR,qRT-PCR和WB检测分析表明△vflR缺失株中Hcp的表达和分泌显著降低,AvflI缺失株中Hcp蛋白的表达和分泌没有显著变化,说明VflI-VflR系统通过VflR正性调控T6SS2的活性。为了进一步明确调控作用是否发生在转录水平,我们将T6SS2核心基因簇以及hcpA,hcpB和hcpC启动子区的重组报告载体转入野生株以及vlfR缺失株中,测定了报告载体在这些菌株中的冷光值,发现在野生株中的冷光值远远大于vflR缺失株中的冷光值,说明VflR可能在转录水平正性调节T6SS2核心基因簇和三个hcp-VgrG基因簇的表达。总之,我们的研究提示了密度感应系统AHL和CAI-1/AI-2分别通过调控子VflS和VflR正性调节河弧菌T6SS2的表达和功能,其调节作用发生在核心基因和三个hcp-VgrG基因簇的启动子水平。