植物的分枝发育在植物的生长形态中扮演着十分重要的角色,这一过程涉及到形态的建成和营养的分配。植物的分枝最初来源于腋芽的产生,腋芽的生长会消耗大量的营养物质。烟草(Nicotiana tabacum)作为一种重要的模式植物和经济作物,研究烟草分枝基因的功能,不仅有利于对分枝机制的认识,而且能够有效的减少烟草栽培过程中分枝的产生,为获得高品质的烟叶提供潜在的靶标基因。据不完全统计,全国各地烟区每年购买抑制腋芽的农药费用高达数10亿元。因此,制备出少腋芽或无腋芽的烟草素材对于烟草农业具有重要意义。目前的研究表明,TCP转录因子家族对多种植物侧枝的调控发挥着重要的作用,其成员BRC1在拟南芥、番茄、豌豆等植物中参与调控腋芽的生长发育,然而目前还不清楚该转录因子是否在烟草腋芽生长发育中发挥功能。本研究以红花大金元烟草为研究对象,鉴定获得了两个与拟南芥AtBRC1同源的NtBRC1b基因,即NtBRC1b-1和NtBRC1b-2。进一步利用CRISPR/Cas9敲除等方法,探究了NtBRC1b对烟草腋芽生长发育的影响,利用双荧光素酶报告实验和酵母单杂交实验分析了烟草NtBRC1b对脱落酸合成相关的9-CIS-环氧-己烯二酸二氧合酶3基因(NtNCED3)转录的调控作用。主要获得了以下结果:1.烟草NtBRC1b基因的鉴定、组织表达特征和亚细胞定位利用已报道的拟南芥AtBRC1蛋白序列对烟草基因组数据库进行blast检索分析,共获得了四个序列相似的基因,分别命名为NtBRC1a-1、NtBRC1a-2、NtBRC1b-1和NtBRC1b-2。进一步克隆获得NtBRC1b-1和NtBRC1b-2的氨基酸编码(CDS)序列,对预测基因序列进行更正。将克隆得到的CDS序列与烟草基因组序列比对分析,发现NtBRC1b-1基因有2个外显子,而NtBRC1b-2为单外显子。氨基酸多序列比对表明,NtBRC1b-1和NtBRC1b-2的氨基酸序列含TCP转录因子家族保守的TCP结构域(TCP domain)。系统进化树分析显示,烟草NtBRC1b-1和NtBRC1b-2与番茄及马铃薯的BRC1b聚为一支。组织表达谱分析显示,NtBRC1b-1和NtBRC1b-2在烟草腋芽和叶中高量表达。亚细胞定位结果表明,NtBRC1b-1和NtBRC1b-2的表达均定位于叶绿体和细胞质中。2.烟草NtBRC1b对腋芽发育的调控作用野生型烟草中的打顶实验显示,打顶后的腋芽迅速生长,而NtBRC1b-1和NtBRC1b-2的表达量显著下降,暗示NtBRC1b是烟草腋芽生长发育的负调控因子。我们进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对烟草NtBRC1b-1和NtBRC1b-2基因进行敲除,成功获得了敲除突变个体。以此为基础,对获得的再生植株进行打顶实验。实验结果显示,单基因(NtBRC1b-1或NtBRC1b-2)敲除植株的腋芽长度大于野生型植株,双基因(NtBRC1b-1和NtBRC1b-2)敲除植株的腋芽长度又大于单基因敲除植株,双基因敲除植株的腋芽生长速度快于单基因敲除植株与野生型。综合分析表明,烟草NtBRC1b对腋芽的生长具有抑制作用。为了制备打顶后少腋芽或无腋芽的烟草素材,我们构建了用于烟草NtBRC1b过表达的pCXSN:NtBRC1b重组过表达载体,通过遗传转化成功获得了NtBRC1b过表达转基因烟草素材,为后续的功能分析及分子育种奠定了基础。3.烟草NtBRC1b对NtNCED3基因转录的调控机制考虑到BRC1参与调控脱落酸(ABA)合成,我们进一步分析了烟草NtBRC1b对ABA合成酶基因Nt NCED3转录的调控作用。RT-PCR分析显示,烟草NtBRC1b与NtNCED3基因的表达受ABA诱导上调。克隆获得了烟草NtNCED3基因的启动子,进一步的双荧光素酶报告基因实验表明,NtBRC1b对NtNCED3启动子的活性有促进作用;酵母单杂交实验显示,NtBRC1b与NtNCED3启动子不直接结合。综合分析表明,NtBRC1b正调控NtNCED3基因的转录,但这种调控作用不是通过与NtNCED3启动子的直接结合来实现。本项研究通过生物信息学分析、RT-PCR等实验克隆并鉴定了两个在腋芽和叶中高量表达的基因NtBRC1b-1和NtBRC1b-2。打顶实验显示,当野生型烟草被打顶后,腋芽长度增加,NtBRC1b基因的表达量下降。CRISPR/Cas9敲除实验显示,当烟草NtBRC1b被敲除后,腋芽生长速度加快,腋芽长度增加。以上结果揭示NtBRC1b转录因子是烟草腋芽生长发育的负调控因子。此外,烟草NtBRC1b能够启动下游NtNCED3基因的表达,但是不与该基因启动子直接结合。本研究为烟草腋芽分子调控机制的研究提供了新的线索。