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鳖甲为药食两用传统中药,来源于鳖科动物鳖(Trionyx sinensisWiegmann)的背甲,具有滋阴潜阳,软坚散结,退热除蒸的功效;主治阴虚发热,癥瘕,虚风内动等病症。现代药理学研究表明,鳖甲提取物显示了较强的抗肝纤维化作用;据文献报道,以鳖甲为君药的复方制剂治疗肝纤维化疾患,临床疗效良好。
为了诠释鳖甲抗肝纤维化的物质基础,本论文在中医药理论指导下,通过多学科交叉的研究方法,采用超声提取方法和膜透析分离技术将鳖甲提取物分为不同分子量范围的物质部位,通过其对肝星状细胞增殖的影响及其对肝星状细胞活化、胶原合成的影响等活性筛选方法,确定了分子量小于6000的鳖甲提取物为抗肝纤维化有效物质部位。采用现代色谱分离技术,通过葡聚糖凝胶Sephadex G-25将鳖甲有效物质部位分离为8个分子量段的肽类物质组分(Bj1-Bj8),药理筛选得到3个分子量段肽类物质组分具有抗肝纤维化活性(Bj4、Bj6、Bj7);选择活性较强的Bj6分子量段进一步通过葡聚糖凝胶Sephadex G-15将Bj6分离为16个肽类物质小组分,结合四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT比色法)和酶联免疫吸附剂测定(ELISA)活性筛选,确定了3个活性较强的肽类物质小组分(Bj6-11、Bj6-12、Bj6-13);采用制备高效液相色谱分离方法,从这三个活性较强的肽类物质小组分中分离得到9个肽类成分,药理筛选表明成分2和成分4具有较强抗肝纤维化作用。
采用4700串联飞行时间质谱仪[4700 Proteomics Analyzer(TOF/TOFTM)(Applied Biosystems,USA)],对两种肽类成分进行结构分析,测定结果为:①成分2:分子量为1040.57,氨基酸排序为W L Y P GN T S C(Trp-Leu-Try-Pro-Glv-Asn-Thr-Ser-Cys);②成分4:分子量为583.299,氨基酸排序为Y S G A W(Try-Ser-Gly-Ala-Trp);经NCBI检索,以上两个肽类化合物均为首次从天然界中分离得到。
通过免疫印迹法(Western-blot),从上述抗肝纤维化肽类物质中选择活性较好的化合物“Y S G A W”进行了抗肝纤维化作用机理研究。研究结果表明,该肽类是通过减少Smad3蛋白的磷酸化,减少细胞外基质(ECM)等基因的转录;同时,通过增强基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的活性和降低金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的活性,使降解的ECM增多,从而达到抗肝纤维化的目的。