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伴生豇豆病毒科(Secoviridae)病毒共含有66个确定种和3个暂定种,具有重要的经济重要性,其中10种病毒被我国列为禁止进境的检疫性有害生物。本研究应用简并PCR技术,建立伴生豇豆病毒科病毒的半巢式RT-PCR检测方法和豇豆花叶病毒属病毒的RT-PCR检测方法;对现有南芥菜花叶病毒的RT-PCR方法进行评价,并建立了一个新的RT-PCR检测方法和SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法;利用RT-PCR方法扩增了南芥菜花叶病毒的cp基因序列并进行遗传多样性分析。根据RNA1复制酶保守区域设计简并引物,并筛选出3条简并引物,建立了伴生豇豆病毒科的半巢式RT-PCR检测方法。该方法成功用于扩增20种伴生豇豆病毒科病毒的27个分离物,包括9种豇豆花叶病毒属病毒、2种蚕豆病毒属病毒和9种线虫传多面体病毒属病毒。通过在简并引物的5’端引入测序引物,成功进行PCR产物的直接测序,并且不会影响其通用性。利用该方法,首次测定了 BLMoV和BBSV部分RdRp基因序列。根据该保守区域进行系统发育分析,结果表明该系统发育关系与现有的分类状况高度吻合,且测定的病毒分离物均可以与相应病毒种类具有最近的亲缘关系。该方法具有良好的特异性,从寄主植物中未扩增出预期大小的条带。利用该方法,在来自田间的太子参中检测到蚕豆萎蔫病毒2号。根据RNA2的外壳蛋白基因保守区域设计简并引物,建立了豇豆花叶病毒属的RT-PCR检测方法。该方法成功用于扩增7种豇豆花叶病毒属病毒10个分离物,而不能从其他豇豆花叶病毒亚科病毒和健康寄主植物中扩增到预期大小条带,显示出良好的通用性和特异性。通过在简并引物的5’端引入测序引物(ComoV-2-F2-M4/ComoV-2-R1-M1),成功进行PCR产物的直接测序,并且不会影响其通用性。通过按1:10比例在PCR扩增中同时加入两对引物(ComoV-2-F2-M4/ComoV-2-R1-M1和M4/M1),结果表明其灵敏度可以提高1000倍。另外,在简并引物的5’端引入富含AT的非互补序列,在并未改变其通用性情况下,其灵敏度可以提高100倍。通过序列测定分析,除了 CPSMV(PV-0050),所扩增的病毒分离物均与相应的病毒序列具有最高的序列同源性。通过对已报道的6个检测南芥菜花叶病毒的RT-PCR方法(包含1个新建立的方法)进行理论和实际检测应用方面评价分析。理论分析表明,在Tm值上,ArMV-370-F/ArMV-370-R引物对的温度差超过5℃,其它引物对均相对一致;在序列一致性上,引物对ArMV-2-350F/ArMV-2-350R和引物ArMV-364-R与已知序列具有最高的序列一致性。对来自水仙、百合、郁金香等不同寄主上的25个南芥菜花叶病毒阳性样品进行检测,结果表明,基于引物对ArMV-2-350F/ArMV-2-350R 和引物对 ArMV-364-F/ArMV-364-R 的 RT-PCR 方法均可以从25个阳性样品中扩增到相应大小的条带,具有很好的通用性;而其它引物对的方法则不能够完全扩增到相应大小的条带。特异性分析表明,基于引物对ArMV-2-350F/ArMV-2-350R的RT-PCR方法在同属于豇豆花叶病毒亚科的其他病毒阳性样品和健康的寄主植物中未扩增到与ArMV阳性样品大小相一致的条带。灵敏度比较表明,基于引物对ArMV-2-350F/ArMV-2-350R的RT-PCR方法和引物对ArMV-364-F/ArMV-364-R的RT-PCR方法,其灵敏度相当。因此,新建立的基于引物对ArMV-2-350F/ArMV-2-350R的RT-PCR方法和已报道的引物对ArMV-364-F/ArMV-364-R的RT-PCR方法具有良好的通用性、特异性和灵敏性,能够满足日常检测的需要。通过对2011-2013年来自荷兰的水仙、百合、郁金香种球上的21个ArMV分离物进行RT-PCR扩增和序列测定,成功获得完整的cp基因序列(1515 bp)。序列分析表明,21个ArMV分离物之间的cp基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为85.8%～99.9%和92.1%～100.0%,与已报道的蜂斗菜分离物同源性分别为71.6%～73.1%(核苷酸)和75.9%～78.3%(氨基酸),而与已报道其它分离物的氨基酸序列同源性均在89.7%～99.2%。系统发育分析表明,不同分离物间可形成3个类群,蜂斗菜分离物单独形成一个类群Ⅲ,而其他分离物均在其他2个类群中。其中,本研究所研究的12个水仙分离物属于Ⅰ群,而8个百合和郁金香分离物则属于Ⅱ群。因此,即使来自同一国家的ArMV分离物,也可显示出很丰富的遗传多样性。根据cp基因保守区域设计引物,建立了南芥菜花叶病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光RT-PCR检测方法。所建立的方法其标准曲线相关系数为0.9972,扩增效率达到87.2%,且具有良好重现性。灵敏度检测显示,该方法可检测到1.0×102 copies/μL～1.O×101 copies/μL 的模板,,比普通 RT-PCR 方法提高 10～100倍。特异性分析显示,具有良好的特异性。利用所建立的方法,对百合、水仙、郁金香等病毒分离物进行检测,在阳性样品中均检测到荧光信号,具有良好的扩增曲线,扩增产物的溶解曲线仅出现单特异峰。因此,所建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光RT-PCR方法具有良好的重现性、灵敏性和特异性,可用于南芥菜花叶病毒的实验室检测。