骨骼肌组织工程的建立为各种骨骼肌疾病(肌营养不良、脊髓性肌萎缩等)提供了治疗希望,也使整形外科治疗创伤、肿瘤切除、失神经支配所致的肌组织缺失进行外科重建成为可能[1,2],许多学者致力于骨骼肌的体外构建和替代研究,试图创建功能化的肌组织。经过多年的探索和努力,一些权威的研究组取得了相当的成绩,不断推进骨骼肌组织工程的研究进展：Powell等采用胶原和基质成功构建三维骨骼肌组织,并对构建组织施加机械剌激,确保体外培养肌组织的形成、分化和收缩功能形成；Dennis和Kosnik则探索出三维骨骼肌组织的自组装模式,作者称其构建肌组织为Myooids,在横向电刺激时具有持续的兴奋性和收缩功能。德国的Bach研究组进行了成肌细胞与纤维蛋白三维支架的复合培养,获得了具有极性分化功能的多核肌管[7,8]。然而,体外条件下进行骨骼肌组织的构建仍面对诸多挑战,尤其在神经化方面。在体研究肌肉的神经支配十分困难,目前研究人员一般采用将成肌细胞与神经元细胞体外共培养来研究成肌细胞与神经细胞的相互作用,并取得了一系列进展。比较经典的是从动物胚胎的脊髓获取神经元细胞进行纯化,然后共培养。Wagner共培养小鼠成肌细胞和胚胎大鼠脊髓,发现共培养组的分化肌管表达更高密度的乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor, AchRs),肌管具有更强的导电能力。Das[10]等将大鼠的神经细胞和肌细胞直接联合培养,发现两者之间形成了神经肌肉接头。神经末梢及各种神经递质的缺乏不利于分化肌管的长期存活和收缩功能的维持,在体外条件下成肌细胞与外周神经元的相关性是构建神经化骨骼肌组织的关键因素。上述研究明确了神经元细胞对成肌干细胞的生物学影响,但由于原代分离培养的神经元细胞对体外生存环境要求较高,体外成肌细胞的存活、增殖及分化环境很难同时满足原代分离神经元的生长要求,为体外骨骼肌组织工程构建的开展带来一定困难。PC12细胞是褐家鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系起源于神经嵴,易获得,便于体外培养,细胞增殖能力强,表达神经生长因子(nerve growth factor, NGF)受体TrkA和p75NTR,因此NGF能与其受体结合使ras/raf/MEK/ERK信号通路活化[11-13],使其停止增殖,细胞表型发生明显改变,获得神经元特性,如长出细胞突起、形成突触样结构、具有电兴奋特性等。PC12细胞未分化时合成儿茶酚胺,在NGF的作用下可以合成乙酰胆碱并且长出神经突结构[14]。广泛应用于神经系统疾病的体外研究。周涛[15]等的研究表明,PC12细胞能与原代神经元之间形成突触连接,JEON[16]等发现NGF诱导分化的PC12细胞之间可以形成突触样结构。王静[17]等将诱导分化的PC12细胞与心肌细胞共培养,发现PC12细胞可作为体外再造心肌神经支配研究模型的供体细胞。Glass[18]等的研究发现骨骼肌纤维与PC12细胞共培养时,肌肉细胞中的慢肌球蛋白轻链2的合成水平增高。Defez[19]等也证实了PC12细胞可以影响骨骼肌的分化进程。有关PC12细胞与C2C12细胞的体外共培养及相互的功能影响,目前尚未发现相关的文献报道。鉴于上述研究背景,本研究尝试将已经分化的PC12细胞与成肌细胞进行共培养,观察其对成肌细胞是否具有支配关系,为构建组织工程骨骼肌提供一种新的方法和思路。[目的]用NGF对PC12细胞的诱导分化,通过免疫荧光染色观察NGF对PC12细胞的诱导分化作用。[方法]PC12细胞常规复苏后用含100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素和10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基,种植于培养瓶内,37℃5%CO2培养箱中培养将培养生长状态良好的PC12细胞按2×104/mL密度接种于预先置有小盖玻片的6孔板中,待细胞达到80-90%后,加入浓度为50ug/L NGF的DMEM/F12培养基对PC12细胞进行诱导分化培养,1d换液,相差显微镜下观察PC12细胞形态。分别在分化3d和7d后进行免疫荧光检测。[结果]未分化的PC12细胞呈圆形、短梭形或三角形,有的细胞两端有突起伸出,有的较长,其上还有小的突起,类似神经元轴突。换含有NGF的培养液后,细胞伸出多条树突状突起,长短不一,突起数目不等。神经元突起细长,大体形态与成熟神经元相似。培养72h后,细胞之间相互连接交织成网状。继续培养至第7d,细胞进一步分化。[结论]细胞之间相互连接交织成网状,说明NGF具有促进PC12细胞分化的作用,神经元细胞微管相关蛋白-2(microtubule associated protein-2,MAP-2)是神经元的特异性标志物,主要存在于神经元的胞体和树突中,可作为神经元的标志蛋白PC12细胞免疫荧光MAP-2阳性表达表明在NGF的诱导下,PC12细胞已经分化为较成熟的神经元细胞。[目的]建立PC12细胞和C2C12细胞Transwell共培养体系,通过流式细胞术检测C2C12细胞周期,研究PC12细胞是否干扰C2C12细胞的体外增殖。[方法]细胞培养分组：(1)空白对照组：C2C12细胞单独培养；(2)实验组：C2C12细胞与已分化的PC12细胞共培养；(3)阴性对照组：C2C12细胞与未分化的PC12细胞共培养；以上共培养组均为Transwell小室内接种PC12细胞,六孔板内接种C2C12细胞,细胞浓度为(1.0-1.2)×108/L的C2C12细胞悬液,待细胞贴壁后,将已接种PC12的Transwell小室(孔径为0.4μm)放入六孔板进行共培养,二者接种细胞的比例为1：1,24h后按不同的分组情况更换培养液,实验组加入浓度为50ug/L NGF的DMEM/F12培养基对PC12细胞进行分化培养,空白对照组培养基同实验组,阴性对照组换原有培养基,常规CO2培养箱孵育。另外将C2C12细胞接种到处理好的玻片上,分组及换液同上所述。共培养48h后收集细胞进行流式检测。同时对玻片上的细胞进行免疫荧光蛋白检测。流式结果用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),若差异有统计学意义,则采用LSD检验进行两两比较,P<0.05认为差异有统计学意义。[结果]3组细胞增殖培养48h后,通过流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测仪检测每组3个样本细胞的分裂增殖周期,经统计分析显示不同组差异有统计学意义(F=103.00,P<0.05),LSD检验两两比较显示实验组与其他两组之间DNA合成前期细胞所占百分比差异有统计学意义(P<0.05),反应增殖活力的增殖指数PrI(包括DNA合成期、DNA合成后期和有丝分裂期)差异也有统计学意义(P<0.05)。同时MyoD蛋白免疫荧光检测的阳性表达表明C2C12处于增殖时期,进一步说明已分化的PC12细胞抑制C2C12细胞的增殖。[结论]流式细胞术检测证实已分化的PC12细胞抑制C2C12细胞的增殖,为进一步构建神经化肌组织提供的一个新思路。[目的]建立PC12细胞和C2C12细胞Transwell共培养系统,通过RT-PCR、qPCR及免疫荧光检测C2C12细胞Myogenin、Desmin基因及蛋白的表达,分析PC12细胞细胞能否对C2C12细胞分化产生影响。[方法]细胞培养分组：(1)空白对照组：C2C12细胞单独培养；(2)实验组：C2C12细胞与已分化的PC12细胞共培养；(3)阴性对照组：C2C12细胞与未分化的PC12细胞共培养；以上共培养组均为Transwell小室内接种PC12细胞,六孔板内接种C2C12细胞,细胞浓度为(1.0-1.2)×108/L的C2C12细胞悬液,待细胞贴壁后,将已接种PC12的Transwell小室(孔径为0.4gm)放入六孔板进行共培养,二者接种细胞的比例为1：1,24h后按不同的分组情况更换培养液,实验组加入浓度为50ug/L NGF的DMEM/F12培养基对PC12细胞进行分化培养,空白对照组培养基同实验组,阴性对照组换原有培养基,常规CO2培养箱孵育。分别于第3、7d收集3组C2C12细胞,用Trizol法提取细胞总RNA,用Oligo(dT)逆转录得到cDNA,经特定引物PCR扩增。免疫荧光检测共培养7dMyogenin、 Desmin特异蛋白的表达。结果用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),若差异有统计学意义,则采用LSD检验进行两两比较,P<0.05认为差异有统计学意义。[结果]采用RT-PCR和qPCR对培养3、7d后所获取的C2C12进行检测,可见实验组Myogenin、Desmin基因的表达均高于同一培养时间其他培养组,3d和7d时采用单因素方差分析显示不同组Myogenin基因的表达差异有统计学意义(F=185.153,P<0.05和F=6020.343,P<0.05),不同组Desmin基因的表达差异也有统计学意义(F=2149.081,P<0.05和F=57.612,P<0.05),Myogenin、Desmin特异性蛋白检测显示,实验组荧光蛋白的表达更密集。表明已分化的PC12细胞促进C2C12细胞的分化。[结论]RT-PCR, qPCR及免疫荧光结果表明实验组成肌分化基因Myogenin、Desmin的表达均明显高于其他培养组。已分化PC12细胞促进成肌细胞的分化。