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背景:因现代战争及和平时期交通、建筑等行业的高能量损伤、骨肿瘤切除、骨结核与感染等所致的骨缺损日益常见。作为治疗骨缺损金标准的自体骨移植,由于存在取骨量有限和取骨区并发症,已不能满足骨缺损治疗的需要。利用骨髓干细胞与生物材料结合构建的组织工程骨修复骨缺损的动物实验已获得较为肯定的效果,但其缺点在于MSCs来源少、体外培养扩增周期长、技术条件高,从而影响了其在骨缺损治疗中的应用。自体红骨髓经皮注射在临床治疗骨不连和填充骨缺损等方面已取得一定的成功,但应用直接注入的方法,局部干细胞容易流失,影响了疗效。SCR是近年来欧美学者报道的骨髓干细胞富集技术之一,主要是通过基质材料适当的网孔结构和良好的表面黏附性能,使骨髓流经时选择性滞留利于成骨的干细胞及促成骨因子等成分,所构建的TEB即刻回植修复骨缺损,可获得较理想的成骨效果。但由于受到知识产权保护和入关限制的影响,该技术及相关产品至今难以在我国临床应用。为了SCR技术能在我国推广应用,本课题组在前期实验已经对经PLL修饰的人DBM作为富集基质材料的性能进行了检测,同时观察其在裸鼠皮下的成骨效果,并发现其在裸鼠皮下的成骨效果与体外常规构建的组织工程骨相当。目的:(1)在前期工作的基础之上,验证经PLL修饰的DBM富集基质材料通过SCR技术构建的TEB在山羊横突间融合模型的成骨效果。(2)初步探讨SCR技术快速构建TEB的成骨机制。(3)SCR技术骨髓富集装置的制备及其优化参数的测定。方法:(1)青山羊PLL-DBM材料的制备。采用多聚左旋赖氨酸修饰青山羊脱钙骨基质制备一种骨髓干细胞富集基质材料,用X射线能谱分析材料钙磷的含量、扫描电镜观察其显微结构、氨基酸成分分析检测PLL与DBM的复合情况、并对其生物力学性能进行检测。(2)成骨能力观察。应用SCR技术术中富集骨髓细胞快速构建TEB,在青山羊横突间融合模型上观察其成骨能力。将24只山羊随机分成两组(Ⅰ组和Ⅱ组),每组12只。骨移植材料分为如下四组:ⅠA组:PLL-DBM富集骨髓后构建的TEB;ⅠB组:等量自体髂骨;ⅡC组:DBM骨髓浸泡;ⅡD组:空白DBM。将ⅠA组和ⅠB组移植材料分别植入第Ⅰ组山羊个体的腰3/4左右横突间隙;ⅡC组和ⅡD组移植材料分别植入第Ⅱ组山羊个体的腰3/4左右横突间隙。分别于术后第8、16周分批处死山羊,取融合段标本行X线片及X线评分、三维CT及CT值检测、组织学观察及评分、生物力学性能检测,评价其成骨能力。(3)成骨机制的探讨。①应用SCR技术使骨髓流经PLL-DBM材料构建TEB,通过纤维母细胞集落形成单位计数计算PLL-DBM材料对骨髓干细胞的富集效果,ELISA法检测富集前后骨髓上清中PDGF、IGF-I因子表达。②采用SCR技术使PLL-DBM富集骨髓后快速构建TEB,然后将构建的TEB持续冷冻干燥36h去掉细胞成分,分别将SCR技术构建的TEB(SCR组)、冷冻干燥去细胞的TEB(FTEB组)、单纯DBM(DBM组)植入裸鼠皮下,分别于4、8天取材,HE染色观察组织块上所募集的细胞情况,于第4、8、12周应用X线摄片观察植骨处影像密度、术后12周进行CT扫描并计算植骨区CT值、HE染色观察植骨区组织学改变和成骨效果。(4)骨髓富集装置的制备及其优化参数的测定。根据SCR技术原理,自行设计研制骨髓富集装置;应用SCR技术使骨髓流经富集基质材料,通过检测富集前后PLL-DBM对骨髓有核细胞的富集效果,确定最佳循环次数以及骨髓的流速。结果:(1)X射线能谱分析显示单纯DBM及PLL-DBM材料均没有明显的钙磷特征波峰;氨基酸成分分析显示PLL-DBM及单纯DBM中胶原类氨基酸(GlY、Arg、LYs)含量均高,而无明显色氨酸(Trp)、酪氨酸(TYr)和半光氨酸(CYs)等强抗原性氨基酸波峰,二者相比无明显差异,但PLL-DBM较单纯DBM有明显的赖氨酸(Lys)波峰;PLL在材料内外表面形成均匀的乳白色涂层,PLL-DBM孔隙率为(70±6)%,孔径为472.5l±7.02μm,孔与孔之间有约100μm左右小孔贯通,孔隙内部有大量孔隙相互连通,并形成蜘蛛网样的网孔结构;生物力学性能检测显示当材料发生60%压缩形变时,PLL-DBM材料在最大载荷、抗压强度明显较DBM低(n=10,P=0.022,P=0.012),而在弹性模量二者没有明显差异(n=10,P=0.225)。(2)X线显示:术后第8周时ⅠA组融合范围不如ⅠB组宽,只是在内侧靠近椎体处有较多的成骨,但明显较ⅡC组成骨明显,ⅡD组无明显成骨;第16周ⅠA组、ⅠB组的融合范围基本相当,均完全愈合,骨密度与横突的骨密度基本一致;ⅡC的融合范围明显较ⅠA组、ⅠB组窄,只是在内侧靠近椎体的位置有部分融合;ⅡD组基本无融合,只是在横突间存在岛状的成骨片。X评分第8周ⅠA组为7.17±1.17(n=6) ,明显低于ⅠB组的9.00±1.10(n=6,P<0.05),但明显高于ⅡC的5.00±0.89(n=6)和ⅡD组的2.00±1.10(n=6);到术后第16周时,ⅠA组与ⅠB组的评分分别是10.00±1.79、11.00±1.67,二者无明显差异(n=6,P>0.05),但明显高于ⅡC、ⅡD组。第16周三维CT显示:ⅠA、ⅠB组的CT值分别是696.76±102.75、766.03±69.24,二者无明显差异(n=6,P>0.05),均明显高于较ⅡC组的488.63±76.40(n=6,P<0.01),ⅡC组CT值高于D组的91.83±31.87(n=6,P<0.01)。组织学评分显示与X线评分类似的结果。术后第16周取移植材料融合段行生物力学性能检测,结果显示:ⅠA、ⅠB组在最大载荷、抗弯强度比较均无明显差异(n=6,P>0.05),ⅠA组较C组高(n=6,P<0.01,P<0.05),ⅠB组较ⅡC组高(n=6,P<0.01, P<0.01),ⅡC组明显较ⅡD组高(n=6,P<0.01)。(3)纤维母细胞集落形成单位(CFU-F)计数显示PLL-DBM材料对骨髓干细胞的浓度富集倍数为5.68±0.49倍,而未经PLL修饰的DBM的富集倍数仅为2.23±0.27倍,二者有显著异(n=4,P<0.01)。PLL-DBM材料对PDGF、IGF-I两种因子的浓度富集倍数分别是13.624±1.251,36.311±5.562 (n=4)。(4)裸鼠皮下成骨实验观察到,术后第4天组织块HE染色,SCR组及FTEB组置入材料上均可见较多的由植入区周围募集到组织块上的有核细胞,第8天组织块上募集的细胞更多。术后第4周三组均没有明显的骨显影,第8周SCR组以及FTEB组已经有较明显的骨显影,空白DBM组部分吸收,第12周X线片显示SCR组和FTEB组植入物呈现高密度的钙化影像,DBM组未见高密度影像出现,植入材料基本吸收, CT结果显示SCR组成骨区CT值为(687.67±18.55)HU(n=6),FTEB组成骨区CT值为(674.33±12.21)HU(n=6),DBM组成骨区CT值为(57.88±5.47)HU(n=6)、组织学观察均显示FTEB组具有与SCR组相当的成骨能力,空白DBM组材料已经基本吸收,没有类骨组织形成。(5)自制富集器最优化的组合功能参数为:循环次数4次/骨髓流速为(100ml/3分钟),更多的循环次数与更慢的骨髓流速组合参数并不表现出更佳的富集效果。结论:(1)制备的同种异体青山羊PLL-DBM材料具有天然的三维空间结构和促进细胞黏附的PLL,生物力学弹性模量好,是一种较理想的骨髓干细胞富集基质材料。(2)SCR技术快速制备的TEB具有高成骨活性,在山羊脊柱横突间融合模型中成骨能力与自体骨相当。(3)应用SCR技术能使基质材料PLL-DBM中富集较高浓度的骨髓干细胞,同时能富集较高浓度的骨生长因子。(4)基质材料中所富集的骨髓干细胞和骨生长因子通过其自身的作用以及募集受体植骨区周围的细胞和生长因子共同参与成骨。(5)SCR技术快速构建的TEB经去细胞处理后仍然具有较高的成骨活性,说明富集基质材料上所富集的骨生长因子以及其所募集的细胞和生长因子共同参与成骨是SCR技术构建的TEB高成骨活性的主要机制,材料中所富集骨髓干细胞只发挥了次要作用。(6)自制的富集器操作方便,功能齐全,可根据需要调节其循环次数、骨髓流速等功能参数,以PLL-DBM为基质材料,其优化组合功能参数为:4次循环/骨髓流速(100ml/3分钟)。