论文部分内容阅读
目的：l、研究体内三维（three-dimensional,3D）重构外泌汗腺中明细胞、暗细胞、肌上皮细胞、导管部内层细胞和外层细胞分化时间过程的差异，探讨与正常胚胎发育过程中汗腺细胞分化的相似性和差异性；2、探索体内3D重构外泌汗腺的血管营养和神经支配情况，并与人体外泌汗腺的血管营养、神经支配进行比较；3、通过抑脂质子密度加权MRI序列技术检测体内3D重构外泌汗腺液体分泌功能。
方法：1、将获取的人全层皮肤标本去除皮下脂肪，以2mg/mlⅡ型胶原酶消化分离汗腺，挑取出完整的线圈状汗腺进行汗腺细胞原代培养。当汗腺细胞达70%-80%融合时，去除汗腺组织后收集细胞制成细胞悬液，将细胞悬液与Matrigel混合均匀，皮下注射至21只正常的成年无胸腺裸鼠腹股沟皮下进行体内3D培养。在注射后第2、3、4、5、6、8和12周的时间点，每个时间点处死3只裸鼠，完整取出胶栓，固定、石蜡包埋、切片。HE（hematoxylinandeosin，HE）染色和免疫荧光染色检测分泌细胞特异性抗原细胞角蛋白7(Cytokeratin7，K7)、明细胞特异性抗原碳酸酐酶Ⅱ（CarbonicanhydraseⅡ，CAⅡ）、暗细胞特异性抗原巨大囊肿病液体蛋白-15（Grosscysticdiseasefluidprotein-15，GCDFP-15）、肌上皮细胞特异性抗原α平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleactin，?-SMA）、导管内层细胞特异性抗原S100钙结合蛋白P（S100CalciumBindingProteinP，S100P）和导管外层细胞特异性抗原S100钙结合蛋白A2（S100CalciumBindingProteinA2，S100A2）的表达，明确体内3D重构汗腺不同细胞分化时间过程，并与人在体汗腺发育进行比较分析。2、正常成年无胸腺裸鼠分两组，汗腺细胞+Matrigel组和单纯Matrigel组：将混合均匀的含有汗腺细胞的Matrigel和单纯Matrigel注射至裸鼠腹股沟皮下进行体内3D培养。10周后处死裸鼠，取出胶栓，4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片。HE染色和免疫荧光染色检测总神经纤维标志物蛋白基因产物9.5（Proteingeneproduct9.5，PGP9.5）。肾上腺素能神经纤维标志物酪氨酸羟化酶(Tyrosinehydroxylase，TH)、胆碱能神经纤维标志物乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）和血管活性肠肽（Vasoactiveintestinalpolypeptide，VIP）、以及血管标志物血小板-内皮细胞粘附分子（Plateletendothelialcelladhesionmolecule-1，CD31）和血管假性血友病因子（vonWillebrandfactor，vWF），对结果进行分析并与人正常皮肤组汗腺周围血管神经进行比较。3、实验分为SD大鼠足垫皮肤组、汗腺细胞+Matrigel裸鼠皮下接种组和Matrigel裸鼠皮下接种组。首先用抑脂质子密度加权MRI序列检测毛果芸香碱和生理盐水注射后SD大鼠足垫中的感兴趣区域（Regionofinterest，ROI）质子的变化，如果毛果芸香碱注射后较注射前氢质子有明显升高，而生理盐水注射后较注射前氢质子无明显变化，则提示抑脂质子密度加权MRI序列用于检测汗腺泌汗功能的方法可行。在此基础上，利用此技术获取毛果芸香碱注射前后汗腺细胞+Matrigel组和Matrigel组皮下形成的胶栓ROI质子的变化图像，并进行分析和绘图，测定3D重构汗腺的液体分泌功能。
结果：1、植入后第2周首先检测到S100P和S100A2的表达，第3周检测到K7和?-SMA的表达，第4周检测到GCDFP-15和CAII的表达。在3D重构外泌汗腺中，导管部细胞分化先于分泌部。植入后8周，这些标记物的表达在3D重构外泌汗腺中的分布与人正常汗腺中的分布相似，并且表达这些标记物的3D重构腺体的百分比保持稳定。2、免疫荧光染色检测发现植入10周后重构的外泌汗腺中的总神经纤维标记物PGP9.5，肾上腺素能神经纤维标记TH和胆碱能神经纤维标记物AChE和VIP的荧光信号环形包围着3D重构腺体，有许多CD31和vWF阳性血管长入胶栓，滋养了3D重构汗腺，与人在体外泌汗腺表达相似。3、大鼠足垫中ROI的平均质子强度在NS注射前后没有明显变化，毛果芸香碱注射后较注射前平均质子强度明显增加，结果与经典的碘-淀粉出汗试验相匹配。在NS注射前后Matrigel组和汗腺细胞+Matrigel组的平均质子强度没有明显的变化，在Matrigel组中，毛果芸香碱注射前后平均质子强度也没有明显的变化。汗腺细胞+Matrigel组中ROI的平均质子强度在毛果芸香碱注射后较注射前明显增加，且强度的时间过程与正常外泌汗腺中一致。
结论：1、3D重构外泌汗腺中不同细胞类型的分化与胚胎发育过程一致。2、3D重构外泌汗腺是有血管营养，并受胆碱能和肾上腺素能双重神经纤维支配。3、3D重构汗腺具有液体分泌功能。
方法：1、将获取的人全层皮肤标本去除皮下脂肪，以2mg/mlⅡ型胶原酶消化分离汗腺，挑取出完整的线圈状汗腺进行汗腺细胞原代培养。当汗腺细胞达70%-80%融合时，去除汗腺组织后收集细胞制成细胞悬液，将细胞悬液与Matrigel混合均匀，皮下注射至21只正常的成年无胸腺裸鼠腹股沟皮下进行体内3D培养。在注射后第2、3、4、5、6、8和12周的时间点，每个时间点处死3只裸鼠，完整取出胶栓，固定、石蜡包埋、切片。HE（hematoxylinandeosin，HE）染色和免疫荧光染色检测分泌细胞特异性抗原细胞角蛋白7(Cytokeratin7，K7)、明细胞特异性抗原碳酸酐酶Ⅱ（CarbonicanhydraseⅡ，CAⅡ）、暗细胞特异性抗原巨大囊肿病液体蛋白-15（Grosscysticdiseasefluidprotein-15，GCDFP-15）、肌上皮细胞特异性抗原α平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleactin，?-SMA）、导管内层细胞特异性抗原S100钙结合蛋白P（S100CalciumBindingProteinP，S100P）和导管外层细胞特异性抗原S100钙结合蛋白A2（S100CalciumBindingProteinA2，S100A2）的表达，明确体内3D重构汗腺不同细胞分化时间过程，并与人在体汗腺发育进行比较分析。2、正常成年无胸腺裸鼠分两组，汗腺细胞+Matrigel组和单纯Matrigel组：将混合均匀的含有汗腺细胞的Matrigel和单纯Matrigel注射至裸鼠腹股沟皮下进行体内3D培养。10周后处死裸鼠，取出胶栓，4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片。HE染色和免疫荧光染色检测总神经纤维标志物蛋白基因产物9.5（Proteingeneproduct9.5，PGP9.5）。肾上腺素能神经纤维标志物酪氨酸羟化酶(Tyrosinehydroxylase，TH)、胆碱能神经纤维标志物乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）和血管活性肠肽（Vasoactiveintestinalpolypeptide，VIP）、以及血管标志物血小板-内皮细胞粘附分子（Plateletendothelialcelladhesionmolecule-1，CD31）和血管假性血友病因子（vonWillebrandfactor，vWF），对结果进行分析并与人正常皮肤组汗腺周围血管神经进行比较。3、实验分为SD大鼠足垫皮肤组、汗腺细胞+Matrigel裸鼠皮下接种组和Matrigel裸鼠皮下接种组。首先用抑脂质子密度加权MRI序列检测毛果芸香碱和生理盐水注射后SD大鼠足垫中的感兴趣区域（Regionofinterest，ROI）质子的变化，如果毛果芸香碱注射后较注射前氢质子有明显升高，而生理盐水注射后较注射前氢质子无明显变化，则提示抑脂质子密度加权MRI序列用于检测汗腺泌汗功能的方法可行。在此基础上，利用此技术获取毛果芸香碱注射前后汗腺细胞+Matrigel组和Matrigel组皮下形成的胶栓ROI质子的变化图像，并进行分析和绘图，测定3D重构汗腺的液体分泌功能。
结果：1、植入后第2周首先检测到S100P和S100A2的表达，第3周检测到K7和?-SMA的表达，第4周检测到GCDFP-15和CAII的表达。在3D重构外泌汗腺中，导管部细胞分化先于分泌部。植入后8周，这些标记物的表达在3D重构外泌汗腺中的分布与人正常汗腺中的分布相似，并且表达这些标记物的3D重构腺体的百分比保持稳定。2、免疫荧光染色检测发现植入10周后重构的外泌汗腺中的总神经纤维标记物PGP9.5，肾上腺素能神经纤维标记TH和胆碱能神经纤维标记物AChE和VIP的荧光信号环形包围着3D重构腺体，有许多CD31和vWF阳性血管长入胶栓，滋养了3D重构汗腺，与人在体外泌汗腺表达相似。3、大鼠足垫中ROI的平均质子强度在NS注射前后没有明显变化，毛果芸香碱注射后较注射前平均质子强度明显增加，结果与经典的碘-淀粉出汗试验相匹配。在NS注射前后Matrigel组和汗腺细胞+Matrigel组的平均质子强度没有明显的变化，在Matrigel组中，毛果芸香碱注射前后平均质子强度也没有明显的变化。汗腺细胞+Matrigel组中ROI的平均质子强度在毛果芸香碱注射后较注射前明显增加，且强度的时间过程与正常外泌汗腺中一致。
结论：1、3D重构外泌汗腺中不同细胞类型的分化与胚胎发育过程一致。2、3D重构外泌汗腺是有血管营养，并受胆碱能和肾上腺素能双重神经纤维支配。3、3D重构汗腺具有液体分泌功能。