偏头痛是一种复杂的神经功能障碍,表现为发作性中度到重度的搏动性头痛,可伴恶心、呕吐、畏声或畏光现象。偏头痛在全球范围的发病率超过15%并逐年递增,目前没有有效的预防手段。压力、激素水平波动、某些药物(如硝酸甘油)的使用等都可以诱发偏头痛。偏头痛引起痛觉敏化已在临床患者和动物实验中得到证实。大部分偏头痛患者会伴发皮肤的异常疼痛,对刺激的敏感性增强。临床研究表明,异常性疼痛是引发慢性偏头痛的危险因素之一,因此痛觉敏化可能是偏头痛慢性化的潜在机制。5-HT受体、降钙素基因相关肽(CGRP)受体等在偏头痛发生发展中的作用机制得到较多关注,但是α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体在其中的具体作用机制研究较少。AMPA受体属于离子型谷氨酸受体,介导中枢神经系统快速的兴奋性突触传递,其功能受到AMPA受体亚基间的相互作用、C末端磷酸化修饰等因素的调节。伤害性刺激可以引起中枢神经系统中AMPA受体磷酸化,促进突触定位及受体转运,在炎性痛和神经病理性疼痛的关键环节发挥作用。因此AMPA受体很可能在偏头痛引起痛觉敏化过程中起重要作用。三叉神经血管系统由脊髓至三叉神经节V1分支处硬脑膜和大血管的传入纤维,和三叉神经至脑干三叉神经脊束核尾侧亚核(Sp5C)的传出纤维组成。目前认为它是偏头痛发生病理生理学的关键组成部分,也是偏头痛引起痛觉敏化的重要中枢。脑干Sp5C所在的三叉神经颈髓复合体(TCC)作为一个重要的传递枢纽,将伤害性信息传递到丘脑和更高级中枢,参与偏头痛的痛觉敏化。很多研究表明,偏头痛发作时Sp5C所在的脑干区域神经元被激活。临床上使用一氧化氮(NO)供体硝酸甘油(NTG)诱导偏头痛发作也同样观察到脑干、丘脑和皮层的激活。NTG诱导的偏头痛模型是偏头痛研究中常用的动物模型之一,临床上NTG可被用来诱导偏头痛患者的急性头痛发作,也可以诱导健康受试者出现急性的偏头痛样痛。实验动物研究也证实,NTG可诱导啮齿类动物偏头痛相关的行为学及病理生理学改变,并且作用能够被治疗偏头痛的药物所抑制。因此本实验中,我们利用NTG诱导偏头痛小鼠模型,研究AMPA受体主要亚基GluA1在小鼠偏头痛引发痛觉敏化中的作用机制。目的利用NTG诱导的小鼠偏头痛模型,探讨三叉神经脊束核尾侧亚核中AMPA受体亚基GluA1在偏头痛模型小鼠痛觉敏化中的作用机制。方法1.利用不同剂量NTG(1,5,10mg/kg,i.p.)诱导小鼠偏头痛模型,检测偏头痛相关行为学改变,包括自发痛检测和皮肤机械刺激痛觉敏化程度测定,并明确NTG诱导的小鼠偏头痛模型是否存在性别差异。2.免疫荧光检测模型小鼠Sp5C神经元的c-fos表达,以及AMPA受体亚基GluA1的表达情况。3.利用Western blot方法和GluA1磷酸化缺陷小鼠明确GluA1磷酸化在NTG诱导偏头痛小鼠痛觉敏化中的作用。4.利用Western blot方法、体外细胞钙成像技术及选择性钙通透型AMPA受体拮抗剂(NASPM)的使用确定磷酸化介导的钙通透型AMPA受体上调在模型小鼠痛觉敏化中的作用。5.使用免疫荧光法检测Sp5C中TNFα受体与AMPA受体亚基GluA1的共表达情况。6.Western blot检测模型小鼠Sp5C中TNFα的蛋白表达。7.使用TNFα基因敲除小鼠明确TNFα在NTG模型小鼠痛觉敏化中的作用。8.Western blot方法检测脑室注射TNFα后Sp5C中GluA1磷酸化水平变化,明确NTG引起的TNFα上调对GluA1磷酸化的作用。结果1.NTG诱导偏头痛小鼠出现痛觉敏化。10mg/kgNTG诱导野生型(WT)小鼠出现明显的偏头痛样痛(自发痛)和随后出现的痛觉敏化。NTG模型组小鼠出现明显的畏光行为,头面部疼痛表情评分(MGS)明显提高;头面部和足底机械刺激疼痛敏感性显著增高。5 mg/kg NTG诱导小鼠出现痛觉敏化和轻微的自发痛;1 mg/kg NTG不能诱导小鼠自发痛或痛觉敏化的出现。雌性NTG模型小鼠的疼痛相关行为学改变与雄性小鼠无明显差异。2.NTG模型组小鼠Sp5C中出现c-fos阳性神经元,AMPA受体亚基GluA1在Sp5C神经元上大量表达。3.GluA1 Ser831位点磷酸化在NTG模型小鼠痛觉敏化中起关键作用。Western blot结果显示NTG显著增强三叉神经节(TG)和Sp5C中GluA1 Ser831位点磷酸化水平(总GluA1的表达水平没有明显改变),但不影响GluA1 Ser845位点。与WT小鼠相比,GluA1 Ser831A磷酸化缺陷小鼠在NTG注射后疼痛阈值下降轻微。4.GluA1 Ser831位点磷酸化促进受体转运上调钙通透型AMPA受体。Western blot结果显示,模型组小鼠Sp5C中GluA1亚基在膜上的表达增高,GluA2亚基表达有所降低,GluA1/GluA2比值升高,受体对钙离子的通透性提高。钙成像实验显示,NTG诱发Sp5C神经元出现显著的钙内流;GluA1 S831A磷酸化位点基因定向突变有效抑制了 NTG诱发的钙内流;选择性钙通透型AMPA受体拮抗剂NASPM剂量依赖性地阻断NTG诱导的钙内流;Sp5C内注射NASPM可以阻断NTG诱导的机械刺激痛觉敏化。以上结果表明NTG诱导的GluA1 Ser831位点磷酸化能够促进受体转运,上调钙通透型AMPA受体,进一步促进模型小鼠痛觉敏化。5.免疫荧光显示Sp5C中大量TNFR1阳性细胞,并与GluA1阳性细胞共定位。6.Western blot结果显示,NTG上调Sp5C中TNFα表达。7.NTG注射后,TNFαKO小鼠出现一定程度的痛觉敏化(与基础值相比);但与WT小鼠相比,TNFα KO小鼠痛觉敏化程度较弱,提示TNFα在NTG模型小鼠的痛觉敏化中发挥一定作用,但可能不是唯一机制。8.TNFα诱导Sp5C神经元出现防御性的内质网应激,促进GluA1 Ser831位点磷酸化,参与模型小鼠痛觉敏化。结论1.NTG诱导小鼠出现偏头痛样痛,引发痛觉敏化。2.NTG诱导AMPA受体亚基GluA1 Ser831位点磷酸化是偏头痛模型小鼠痛觉敏化的关键机制;磷酸化通过上调钙通透型AMPA受体进一步促进痛觉敏化发生。3.NTG上调Sp5C中TNFα表达,间接促进GluA1 Ser831位点磷酸化,参与模型小鼠痛觉敏化。