目的在大鼠心脏缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)及缺血后处理(ischemic postconditioning,IPO)模型上,探讨IPO过程中微小RNA499(micro RNA-499,mi RNA-499)介导的热休克蛋白90(heat-shock protein 90,HSP90)对白细胞介素1(interleukin 1,IL-1)、IL-6及Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR-2)等炎症及免疫因子表达的影响及可能的信号转导机制。背景随着冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease,CHD)(以下简称“冠心病”)的发病率不断增高,冠心病的治疗也越来越受到重视。目前再灌注治疗是冠心病的主要治疗手段,但再灌注的同时往往伴随再灌注损伤(ischemia reperfusion injure,IRI)的出现。IPO是一种已被广泛证实可减轻IRI的心脏保护措施,但其作用机制尚未完全阐明。免疫及炎症反应是IRI形成的重要特征。mi RNA-499被证实与IRI的形成关系密切。我们的前期研究显示作为分子伴侣的HSP90及其介导的信号通路参与了IPO的心脏保护效应,且已有研究证实mi RNA-499对HSP90具有调控作用。因此我们推测,在IPO过程中mi RNA-499通过调控HSP90及其介导的信号转导通路,从而调节心肌的免疫及炎症反应,减轻IRI。为了验证这一假说,本研究将通过大鼠建立心脏IR及IPO模型,应用HSP90抑制剂格尔德霉素(geldanamycin,GA)及干扰mi RNA-499低表达、过表达腺相关病毒,检测IL-1、IL-6及TLR-2等炎症及免疫因子的表达,同时检测蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)等信号因子的表达,探讨IPO中mi RNA-499调控的HSP90信号通路与免疫及炎症反应的内在联系及信号转导机制。本研究将分为三个章节依次展开论述。第一章热休克蛋白90在缺血后处理中的表达变化及其介导的Toll样受体2对IL-1及IL-6等炎症因子表达的影响目的在大鼠IR及IPO模型上探讨IPO对HSP90表达的影响,并通过应用HSP90抑制剂GA,探讨IPO过程中HSP90对TLR-2及IL-1、IL-6等免疫炎症因子表达的影响及可能的信号转导机制。方法第一节,大鼠心脏缺血再灌注及缺血后处理模型的建立。(1)将24只雄性SD大鼠随机均分成三组:(1)假手术(Sham)组:冠状动脉前降支近段只穿缝合线,不结扎,观察2.5h;(2)缺血再灌注(IR)组:冠状动脉前降支近段结扎30min,然后再灌注2h;(3)缺血后处理(IPO)组:冠状动脉前降支近段结扎30min,紧接着进行3次再灌注/缺血处理(再灌注30s,缺血30s),然后再灌注2h。(2)分别在结扎冠脉前后记录大鼠心电图,以心电图改变为标准判断是否成功结扎前降支以及前降支血流是否恢复。(3)实验处理结束后立即剪下心脏,将心室冰冻成硬块后切成2mm左右厚度薄片,并行2,3,5-氯三苯四唑(2,3,5-triphenyhetrazolium chloride,TTC)染色观察心脏梗死面积(IS)。第二节,缺血后处理对心肌组织中热休克蛋白90表达的影响。(1)动物分组同第一节。(2)处理结束后采集大鼠静脉血,收集血清并行酶联免疫法(ELISA)检测HSP90含量。(3)处理结束后剪下大鼠心脏,保留心室前游离壁靠近室间隔部分,行Western Blotting(WB)检测心肌组织中HSP90含量。第三节,热休克蛋白90介导的Toll样受体2对缺血后处理中的IL-1及IL-6等炎症因子表达的影响。(1)将32只雄性SD大鼠随机均分成四组:(1)假手术(Sham)组,(2)缺血再灌注(IR)组,(3)缺血后处理(IPO)组,以上三组动物处理同第一节;(4)缺血后处理+格尔德霉素(IPO+GA)组:大鼠麻醉成功后即经腹腔按0.6mg/kg剂量注射GA溶液,后续处理同IPO组。(2)处理结束后采集大鼠静脉血,收集血清并行ELISA检测HSP90及IL1、IL6、TLR2等免疫及炎症指标含量。(3)处理结束后剪下大鼠心脏,保留心室前游离壁靠近室间隔部分,行WB检测心肌组织中HSP90及IL1、IL6、TLR2等免疫及炎症指标含量。结果第一节,(1)与结扎前相比,结扎后的大鼠心电图出现胸前、下壁及高侧壁多个导联ST段逐渐抬高并与QRS波融合呈墓碑状;行缺血后处理时,松开缝合线后10s左右,原本抬高的ST段明显回落,墓碑状QRS波变窄;此后再次结扎,相应导联ST段再次抬高如前。(2)Sham组各层心肌组织切片均呈砖红色,染色均匀,未见明显异常颜色区域;IR组及IPO组各层心肌组织切片大部分区域呈砖红色,但均出现不同程度灰白色区域,其中IPO组IS[(5.02±0.81)%]较IR组[(9.80±1.30)%]明显减少(P<0.01)。第二节,(1)ELISA检测结果:Sham组(190.5±7.8)pg/m L,IR组(277.3±9.7)pg/m L,IPO组(299.8±11.3)pg/m L。与Sham组比较,IR组及IPO组HSP90含量均显著增加(P<0.05);与IR组比较,IPO组HSP90含量增多(P<0.05)。(2)WB检测结果:与Sham组(0.44±0.03)比较,IR组(0.76±0.06)及IPO组(0.86±0.05)HSP90表达量均明显增加(P<0.05);与IR组比较,IPO组HSP90表达量有所增加(P<0.05)。第三节,(1)ELISA检测结果:HSP90含量的对比:与Sham组比较,IR组、IPO组及IPO+GA组HSP90含量均显著增加(P<0.05);与IR组比较,IPO组HSP90含量增多(P<0.05);与IPO组比较,IPO+GA组HSP90含量减少(P<0.05)。IL-1、IL-6及TLR-2等炎症及免疫指标的对比:与Sham组比较,IR组、IPO组及IPO+GA组IL-1、IL-6及TLR-2含量均显著增加(P<0.05);与IR组比较,IPO组IL-1、IL-6及TLR-2含量减少(P<0.05);与IPO组比较,IPO+GA组IL-1、IL-6及TLR-2含量增加(P<0.05)。(2)WB检测结果:HSP90含量的对比:与Sham组比较,IR组、IPO组及IPO+GA组HSP90含量均显著增加(P<0.05);与IR组比较,IPO组HSP90含量增多(P<0.05);与IPO组比较,IPO+GA组HSP90含量减少(P<0.05)。IL-1、IL-6及TLR-2等炎症及免疫指标的对比:与Sham组比较,IR组、IPO组及IPO+GA组IL-1、IL-6及TLR-2含量均显著增加(P<0.05);与IR组比较,IPO组IL-1、IL-6及TLR-2含量减少(P<0.05);与IPO组比较,IPO+GA组IL-1、IL-6及TLR-2含量增加(P<0.05)。结论(1)IPO可减少心肌IRI后的IS,具有心脏保护作用。(2)IR及IPO均可增加大鼠心肌组织中HSP90表达,IPO可在IR基础上增加HSP90的表达。(3)IPO可在增加HSP90表达的同时减少IL-1、IL-6及TLR-2等炎症及免疫指标的生成;IPO过程中,应用GA可特异性减少HSP90表达,同时增加IL-1、IL-6及TLR-2等炎症及免疫指标的生成。第二章mi RNA-499在缺血后处理中的表达变化及其对热休克蛋白90表达的影响目的在大鼠IR及IPO模型上探讨IPO对mi RNA-499表达的影响,并通过构建和应用mi RNA-499低表达及过表达腺相关病毒,探讨IPO过程中mi RNA-499对HSP90表达的影响。方法第一节,缺血后处理对心肌组织中mi RNA-499表达的影响。(1)动物分组及处理同第一章第一节。(2)处理结束后剪下大鼠心脏,保留前游离壁靠近室间隔部分,行实时荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,q PCR)检测mi RNA-499相对表达量。第二节,大鼠心肌mi RNA-499过表达及低表达腺相关病毒的构建、包装和验证。第一小节,mi RNA-499过表达及低表达腺相关病毒的构建。构建mi RNA-499过表达及低表达基因,并以腺相关病毒为载体,整合进病毒基因序列。第二小节,mi RNA-499过表达及低表达腺相关病毒的包装。将构建好的病毒载体转染至AAV-293细胞(病毒包装),病毒纯化并检测病毒滴度。第三小节,mi RNA-499过表达及低表达腺相关病毒转染效果的验证。将4只雄性SD大鼠随机分为四组:(1)空白对照(C)组:常规饲养2周,不做特殊处理;(2)阴性对照(NC)组:经尾静脉注射阴性对照腺相关病毒,之后常规饲养2周;(3)过表达(mi R499+)组:经尾静脉注射mi RNA-499过表达腺相关病毒,之后常规饲养2周;(4)低表达(mi R499-)组:经尾静脉注射mi RNA-499低表达腺相关病毒,之后常规饲养2周。饲养结束后留取大鼠心脏(心室)标本,行q PCR检测心肌组织中mi RNA-499含量。第三节,缺血后处理中,心肌组织mi RNA-499表达干预对热休克蛋白90表达的影响。(1)将32只雄性SD大鼠随机均分为四组:(1)空白对照(C)组:常规饲养,不做特殊处理,饲养足2周后再行冠状动脉前降支IPO(前降支缺血30min,紧接着进行3次再灌注30s/缺血处理30s,然后再灌注2h);(2)阴性对照(NC)组:经尾静脉注射阴性对照腺相关病毒,之后常规饲养,2周后行IPO;(3)mi RNA-499低表达(mi R499-)组:经尾静脉注射mi RNA-499低表达腺相关病毒,之后常规饲养,2周后行IPO;(4)mi RNA-499过表达(mi R499+)组:经尾静脉注射mi RNA-499过表达腺相关病毒,之后常规饲养,2周后行IPO。(2)处理结束后采集大鼠静脉血,收集血清并行ELISA检测其中HSP90含量。(3)处理结束后剪下大鼠心脏,保留心室前游离壁靠近室间隔部分,行WB检测心肌组织中HSP90含量。结果第一节,q PCR检测结果:与Sham组(1.02±0.07)比较,IR组mi RNA-499表达量(0.68±0.07)减少(P<0.05);与Sham组比较,IPO组mi RNA-499表达量(1.22±0.09)增多(P<0.05)。第二节,(1)成功将mi RNA-499过表达及低表达目的基因整合至腺相关病毒载体。(2)成功包装及纯化病毒,测得mi RNA-499过表达腺相关病毒(HBAAV2/9-rno-mir-499-GFP)及mi RNA-499低表达腺相关病毒(HBAAV2/9-rno-mi R-499-5p-sponge-GFP)滴度均为1.3×1012 v.g./m L,阴性对照病毒(HBAAV2/9-GFP)滴度为1.6×1012 v.g./m L。(3)q PCR检测结果:各组心肌组织中mi RNA-499相对表达量分别为C组1.00、NC组1.08、过表达组4.17及低表达组0.56。第三节,(1)ELISA检测结果:与C组比较,NC组HSP90含量与之无显著差异(P为0.561,>0.05);与NC组比较,mi R499-组HSP90含量减少(P<0.05);与NC组比较,mi R499+组HSP90含量增加(P<0.05)。(2)WB检测结果:与C组比较,NC组HSP90含量与之无显著差异(P为0.852,>0.05);与NC组比较,mi R499-组HSP90含量减少(P<0.05);与NC组比较,mi R499+组HSP90含量增加(P<0.05)。结论(1)IR可减少大鼠心肌中mi RNA-499的表达,IPO则可增加其表达。(2)mi RNA-499低表达可减少IPO过程中HSP90的表达;mi RNA-499过表达可增加IPO过程中HSP90的表达。第三章mi RNA-499介导的热休克蛋白90-Toll样受体2信号通路在缺血后处理中的机制研究目的在大鼠IR及IPO模型上,通过应用mi RNA-499低表达及过表达腺相关病毒,探讨IPO过程中mi RNA-499对TLR-2、IL-1、IL-6等免疫炎症因子以及PKC、JNK等信号因子表达的影响及可能的信号转导机制。方法第一节:缺血后处理中,mi RNA-499介导的热休克蛋白90-Toll样受体2信号通路对IL-1及IL-6等炎症因子表达的影响。(1)动物分组及处理同第二章第三节。(2)处理结束后采集大鼠静脉血,收集血清并行ELISA检测IL1、IL6、TLR2等炎症及免疫指标含量。(3)处理结束后剪下大鼠心脏,保留心室前游离壁靠近室间隔部分,行WB检测心肌组织中IL1、IL6、TLR2等炎症及免疫指标含量。第二节,缺血后处理中,mi RNA-499介导的热休克蛋白90-Toll样受体2信号通路对PKC及JNK等信号因子表达的影响。(1)动物分组及处理同第二章第三节。(2)处理结束后采集大鼠静脉血,收集血清并行ELISA检测PKC及JNK含量。(3)处理结束后剪下大鼠心脏,保留心室前游离壁靠近室间隔部分,行WB检测心肌组织中PKC及JNK含量。结果第一节,(1)ELISA检测结果:与C组比较,NC组IL-1、IL-6及TLR-2等指标含量与之无显著差异(P分别为0.361、0.670、0.906);与NC组比较,mi R499-组相关指标含量增加(P<0.05);与NC组比较,mi R499+组相关指标含量减少(P<0.05)。(2)WB检测结果:与C组比较,NC组IL-1、IL-6及TLR-2等指标含量与之无显著差异(P分别为0.549、0.700、0.544);与NC组比较,mi R499-组相关指标含量增加(P<0.05);与NC组比较,mi R499+组相关指标含量减少(P<0.05)。第二节,(1)ELISA检测结果:与C组比较,NC组PKC及JNK含量与之无显著差异(P分别为0.715、0.454);与NC组比较,mi R499-组PKC及JNK含量均增多(P<0.05);与NC组比较,mi R499+组PKC及JNK含量均减少(P<0.05)。(2)WB检测结果:与C组比较,NC组PKC及JNK含量与之无显著差异(P分别为0.436、0.289);与NC组比较,mi R499-组PKC及JNK含量均增多(P<0.05);与NC组比较,mi R499+组PKC及JNK含量均减少(P<0.05)。结论(1)mi RNA-499低表达可增加IPO过程中的IL-1、IL-6及TLR-2的生成;mi RNA-499过表达则可减轻IPO过程中上述指标的生成。(2)mi RNA-499低表达可增加IPO过程中PKC及JNK的表达;mi RNA-499过表达则可减少IPO过程中PKC及JNK的表达。