研究目的动脉粥样硬化引发的急性冠脉综合征(acute coronary syndromes, ACS),即不稳定性心绞痛(unstable angina)和急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)一直是发达国家以及某些发展中国家的首要致死和致残疾病。据统计,每年全球有超过1900万人罹患突然的冠状动脉疾病(ACS或者猝死),而大部分人事先并无缺血性心脏病等征兆。在我国,随着人民生活水平提高和饮食习惯的改变,动脉粥样硬化及其相关疾病的发病率也呈现逐年升高的趋势,成为主要的死亡原因。临床研究表明引起ACS的主要原因是冠状动脉晚期粥样硬化斑块的突然破裂以及由此引发的血栓形成,而动脉粥样硬化斑块的不稳定是导致斑块破裂的重要原因。因此,研究影响斑块易损性的因素和机制,探索相应的干预方法,对ACS的防治具有重要的价值。动脉粥样硬化发生时血管壁局部的有害刺激,诸如氧化应激、毒性脂质等,可以扰乱内质网的功能,引起内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞等动脉粥样硬化相关细胞发生内质网应激(ER stress)。当ER stress发生时,内质网的未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)将作为一种补偿机制发挥作用。然而,过度的ER stress会导致细胞凋亡,是引发动脉粥样硬化斑块并促进易损斑块形成的一个重要病因。因此,阻断内质网应激可能改善斑块的易损性。四苯基丁酸(4-Phenylbutyric acid, PBA)作为一种化学伴侣,可以有效地缓解内质网应激与UPR的过度活化。用于动脉粥样硬化斑块的干预措施是一种崭新的尝试。IL一17A作为一种促炎性细胞因子,是新的T细胞亚群Thl7的主要效应分子,参与多种炎性疾病的发生和发展,我们和其他学者的研究都显示,IL-17A可以促进小鼠动脉粥样硬化斑块的形成,但在斑块不稳定性中的作用尚不清楚。临床资料数据发现ACS病人外周血IL-17A的水平较稳定性心绞痛和正常人明显升高,提示IL-17A具有促进斑块不稳定性的作用,但在已有的动物模型研究中更加关注IL-17A对于动脉粥样硬化斑块生成的影响,而且相关实验的结果尚存在冲突。我们前期的研究发现IL-17A可诱导人血管内皮细胞的凋亡,在小鼠斑块破裂模型中,IL-17A的水平也有所升高,这提示与斑块发生相比,IL-17A对于晚期斑块稳定性的影响可能更大。但IL-17A与斑块易损性之间的具体因果关系并不清楚,针对IL-17进行抗体干预治疗的效果也不明确。本论文中,我们选取ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠斑块模型,研究内质网应激以及IL-17A对斑块易损性的影响以及相关机制,并分别采用四苯基丁酸(PBA)和IL-17中和性抗体(IL-17mAb)作为干预措施,观察它们增加斑块稳定性的效果和意义。为更好地理解易损斑块的形成机制打下基础,也为临床预防和救治急性冠脉综合征等急性心血管事件提供新的思路。实验方法一、小鼠动脉粥样硬化斑块模型根据研究的侧重点不同,我们分别采用ApoE-/-小鼠早期斑块模型和晚期斑块模型。(一)ApoE-/-小鼠早期斑块模型：8周龄雄性ApoE-/-小鼠高脂喂养2周,随机分为两组：①PBA治疗组,每三天一次腹腔注射PBA,100mg/kg,共注射5周,至总周龄16周；②对照组给以同等剂量PBS腹腔注射。(二)ApoE-/-小鼠晚期斑块模型：8周龄雄性ApoE-/-小鼠高脂饮食喂养8周,确认斑块形成后,随机分组分别进行IL-17A与IL-17中和性抗体(IL-17mAb)干预实验。IL-17A干预实验包括：①IL-17A干预组：腹腔注射重组IL-17A,2μg只,一周一次,注射4周；②对照组：以同等剂量的PBS替代IL-17A。IL-17mAb干预实验包括：①IL-17mAb组：腹腔注射IL-17单克隆抗体(IL-17mAb),50μg/只,一周一次,注射4周；②同型对照组：以大鼠IgG2A作为IL-17mAb同型对照。二、小鼠体重及血脂水平的检测为了检测干预措施对于小鼠一般健康状况的影响以及对脂肪代谢的影响。我们在实验终止前称量每只小鼠的体重。并采集外周血,用全自动生化分析仪检测总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的水平。三、免疫组化以及其他组织染色法为了检测各种干预措施对粥样斑块生成及易损性的影响,我们取小鼠主动脉根部进行连续组织切片,进行如下的项目检测：①H&E染色检测斑块大小、面积；②油红0检测斑块脂质含量；③免疫组化染色检测斑块局部平滑肌细胞、T细胞、巨噬细胞、p-PERK、FOXP3等；④天狼星红染色、Masson三色染色检测胶原蛋白含量；⑤弹性纤维染色检测弹性纤维含量；⑥原位明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶(MMP)活性；⑦TUNEL染色检测斑块凋亡情况；⑧免疫荧光染色检测调节性T细胞(Treg)转录因子FOXP3。组织染色后拍照,用Image-Pro Plus软件测量斑块面积及阳性着色区域面积,并计算阳性区域占斑块总面积的比例进行统计分析。四、酶联免疫吸附法(ELISA)为了说明各种干预措施对体内炎症情况的影响,我们取小鼠外周血,离心获得血清,用ELISA的方法检测IL-23、IL-10、TGF-β、IL-35等动脉粥样硬化相关细胞因子水平。五、实时定量PCR为了更进一步检测斑块局部的炎症情况,我们取实验动物的胸腹主动脉,组织研磨破碎后抽提RNA,实时定量PCR法检测各实验组炎性细胞因子TNF-α、 IL-1β、IFN-γ、IL-17、IL-23、IL-6以及抑炎因子IL-10、TGF-β、IL-35相关亚单位和趋化因子MCP-1、CXCL-10和CX3CL-1的mRNA水平。六、Western blot为了检测PBA体内抑制斑块局部内质网应激的效果,我们取小鼠胸腹主动脉,组织破碎提取蛋白,用Western blot的方法检测内质网应激相关分子p-eIF2α、 eIF2α、sXBP-1的水平。七、流式细胞术(一)调节性T细胞亚群的检测为了检测PBA干预后对调节性T细胞(Treg)水平的影响,我们取小鼠脾脏研磨成单细胞悬液,用PE-Cy5-CD4抗体和PE-Foxp3抗体共染。流式细胞术检测CD4+Foxp3+双阳性细胞占比,即为调节性T细胞亚群比例。(二)巨噬细胞凋亡清除能力的检测为了检测IL-17A对巨噬细胞凋亡清除能力的影响,我们在体外做了巨噬细胞凋亡清除实验。具体方法是以地塞米松腹腔注射诱导的小鼠凋亡胸腺细胞为靶细胞,CFSE染色后加入到小鼠腹腔巨噬细胞中共同培养。用FITC标记的F4/80抗体标染巨噬细胞,流式细胞仪或荧光显微镜检测巨噬细胞中吞噬凋亡细胞的比例。(三)细胞因子微量样本多指标流式蛋白定量技术(CBA)为了节省血清标本、提高检测效率,我们采用流式微量检测技术(CBA)检测更多的细胞因子指标。包括：IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17、 IL-10等。八、统计分析用SPSS统计软件进行数据,数据以均值±标准差的方式表示。非配对的t检验法用于分析干预组与非干预组的差别,以p<0.05作为统计学显著性差异。实验结果一、PBA缓解内质网应激对小鼠斑块易损性的影响1、PBA体内应用对血管局部内质网应激水平的影响对于小鼠胸腹主动脉蛋白样本的分析显示,PBA体内应用后ER stress相关蛋白sXBP-1、p-eIF2a明显减少。斑块局部免疫组化的结果也显示磷酸化PERK (p-PERK)的水平明显下降。说明PBA体内应用可以有效地缓解血管局部内质网应激的发生。2、PBA干预对斑块生成和斑块稳定性的影响与对照组相比,PBA干预组胸腹主动脉斑块数量减少,主动脉根部斑块的面积也明显下降。而且PBA干预组斑块内的平滑肌含量升高、CD3+T细胞浸润减少、凋亡水平明显减少。这些指标提升斑块稳定性明显增加。表明PBA治疗可以有效地减少斑块生成、增加斑块的稳定性。3、PBA干预对小鼠脂质代谢的影响PBA干预组与非干预组的体重及血脂水平均无明显差异,说明PBA体内干预不影响小鼠一般健康状况,也不影响脂肪代谢。排除了血脂改变对于斑块产生影响的可能。4、PBA治疗对于细胞因子的影响外周血ELISA和CBA检测发现PBA干预组促炎性细胞因子如IL-2、IL-4、 TNF-α、IL-17、IFN-γ、IL-23等均没有显著变化。抑炎性的细胞因子IL-35的水平有明显的上升,IL-10有升高的趋势。对于血管局部的检测也显示同样的结果,即促炎性细胞因子的mRNA水平没有显著变化,而抑炎性的IL-10以及IL-35相关亚单位EBi3、IL-12α的mRNA水平有明显升高。这些结果均提示在PBA缓解内质网应激后可以促进抑炎因子的升高。5、PBA治疗对调节性T细胞的影响调节性T细胞是抑炎性细胞因子IL-10、IL-35的主要来源,因此我们检测了PBA干预对于调节性T细胞亚群的影响。流式细胞术检测发现PBA治疗组调节性T细胞亚群的占比明显升高。斑块局部的FOXP3染色也发现PBA组FOXP3阳性数量明显升高。这些结果证实PBA治疗可以导致调节性T细胞亚群的改变,从而引起抑炎因子的升高。6、新的抑炎细胞因子IL-35与动脉粥样硬化的关系在实验中我们发现在PBA治疗组新的抑炎因子IL-35的水平改变最为明显。为了进一步研究IL-35与动脉粥样硬化的关系,我们检测了动物模型中IL-35的水平。我们发现随着斑块的形成,IL-35的水平下降明显。这提示IL-35可能抑制动脉粥样硬化的生成,增加斑块的稳定性。二、IL-17A对小鼠斑块易损性的影响及机制1、IL-17A对晚期斑块大小和易损性的影响尽管H&E染色发现IL-17A干预组斑块的绝对面积和斑块占血管横截面面积的比例较对照组均没有明显的改变,这说明IL-17A不影响晚期斑块的大小。但外源性IL-17A的干预导致斑块脂质含量增加、坏死核心占斑块面积的比例增加、斑块内凋亡数量增加、CD3+T细胞含量增加,而且平滑肌的含量降低。这些都说明IL-17A导致斑块的稳定性下降。2、IL-17A对小鼠体重与脂质代谢的影响与对照组比较,IL-17A干预组的体重无明显改变。外周血中TCH、TG、LDL、 HDL等指标均无变化。这说明IL-17A体内应用不影响小鼠一般状况与脂质代谢,其对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响并非通过影响脂质代谢而产生。3、IL-17A对趋化因子的影响为了研究IL-17A增加斑块CD3+T细胞含量的机制,我们用定量PCR的方法检测了胸腹主动脉局部趋化因子MCP-1、CXCL-10和CX3CL-1的mRNA水平,发现IL-17A处理组MCP-1、CXCL-10的水平明显升高。提示IL-17A可以上调趋化因子的水平,从而增加T细胞等炎症细胞向斑块局部的浸润。4、IL-17A对巨噬细胞和巨噬细胞凋亡清除能力的影响为了研究导致斑块局部凋亡增多的原因,我们在体外检测了oxLDL存在的情况下IL-17A对于巨噬细胞存活力的影响,以及IL-17A对于巨噬细胞凋亡清除能力的影响。在oxLDL存在的情况下加入IL-17A刺激48小时可以导致巨噬细胞死亡增加。对于凋亡清除能力的研究发现IL-17A可以下降巨噬细胞60分钟时的凋亡清除能力,但对更长时间(90分钟以后)的凋亡清除能力没有影响。由此可见,在斑块局部IL-17A可能降低巨噬细胞凋亡清除能力。更重要的是IL-17A与毒性脂质(oxLDL)的共同作用可以导致巨噬细胞死亡,从而减少巨噬细胞的含量,影响凋亡细胞的及时清除,导致斑块局部凋亡数量增加。5、IL-17抗体(IL-17mAb)对晚期斑块易损性的影响为了反向验证IL-17A对于斑块稳定性的影响,也为了观察IL-17抗体干预治疗的效果,我们设计了IL-17阻断性抗体治疗及其同型对照的实验组。与预期结果相符,IL-17mAb没有改变晚期斑块的大小但导致斑块内平滑肌的含量上升和CD3+T细胞水平下降。这些指标均表明应用抗体治疗后可以有效地增加斑块稳定性。具有积极的治疗意义。结论一、PBA干预可以有效地缓解内质网应激,减少动脉粥样硬化斑块的生成并促进斑块的稳定。这一作用可能通过增加调节性T细胞含量,上调免疫负调控因子(IL-10、IL-35)的方式实现。二、IL-17A不影响晚期斑块的大小,但降低斑块的稳定性。IL-17A诱导的巨噬细胞死亡和巨噬细胞凋亡清除能力的降低可能是重要的机制。三、IL-17中和性抗体治疗可增加斑块稳定性。创新性与意义1、发现PBA不仅能够缓解内质网应激,而且可以上调调节性T细胞和抑制性细胞因子水平,减少动脉粥样硬化斑块的生成和斑块易损性。并在小鼠模型中发现工L-35与动脉粥样硬化疾病的关系。这些发现将有助于更好地理解此类疾病的发生发展机制,为以PBA等类似药物用于临床治疗提供了实验依据。2、发现IL-17A对于晚期斑块易损性的影响以及阻断IL-17的积极作用。发现与斑块形成相比,IL-17A对于斑块易损性的影响更加明显。而IL-17A诱导的巨噬细胞死亡和巨噬细胞凋亡清除能力下降可能是重要的机制。在更好理解易损性斑块形成的基础上,也为以IL-17为治疗靶点提供依据。