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锰过氧化物酶是由真菌分泌的一种含有血红素辅基的糖基化的胞外蛋白,在染料脱色和降解过程中起着十分重要作用。本实验利用本实验室自主分离保存的的白腐真菌裂褶菌F17固态发酵所生产的锰过氧化物酶(MnP),对酶进行了分离纯化,研究了锰过氧化物酶(MnP)的酶学性质,并优化了酶活条件。同时初步探索关于裂褶菌F17锰过氧化物酶的基因克隆实验。主要结果如下：(1)锰过氧化物酶(MnP)酶学性质的研究。本实验通过超滤浓缩、DEAE-纤维素DE52离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤等实验步骤,分离纯化得到了电泳纯的锰过氧化物酶。通过对纯化样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,确定该锰过氧化物酶只显示一条带,达到电泳纯。该酶蛋白含量为23μg/ml,最适pH为pH4.5,在0.1mM H2O2中半衰期为4-5min,Mn2+和H2O2,的Km值分别为13.1μM、5.2μM,低于之前已经报道的烟管菌属的锰过氧化物酶,被氧化效率较高。(2)锰过氧化物酶(MnP)酶活力影响因素的研究。Mn2+,H2O2以及酶的用量可以影响MnP酶促反应的效率。通过单因子分析,可以得知：在一定的反应体系中,MnP的酶活随着Mn2+的浓度从0.2mM到1.2mM的上升而上升,但是随着Mn2+浓度继续升高,MnP的酶活开始逐渐下降；当H2O2的浓度从0.02mM上升到0.2mM时,MnP表现出较高的活性,但是H2O2继续从0.2mM上升到0.5mM时,酶活急剧下降；酶活随着酶量的增加而提高,直到酶液达到0.4ml时酶活达到最大。但是高于0.4ml的酶量却使酶活下降。MnP酶促反应本身是一个非常复杂的体系,在MnP酶促反应中,H2O2、Mn2+、酶浓度之中存在着复杂的交互作用和组合效应,每个因素所要求的最佳浓度都会因其它因素的改变而改变。在单因子分析法的基础上,通过full factorial central composite design响应面分析表明：H2O2以及H2O2与酶用量之间的交互作用对酶促反应的作用是最显著的。通过对Mn2+,H2O2以及酶的用量这三个要素进行响应曲面图分析,可以得出：在一定的反应体系中,随着Mn2+浓度的升高,H2O2浓度越高,酶的活性越大；随着酶量的增多,反应体系中Mn2+浓度越高,酶的活性越大。但是,当Mn2+浓度处于比较低的水平时,酶液用量对MnP酶活的影响更加明显；在保持Mn2+浓度为1.6mM时,在4ml体系中,在H2O2浓度为0.15mM酶液用量为0.55ml情况下获得最大的MnP相对酶活。(3)锰过氧化物酶(MnP)对染料脱色的研究。根据响应面分析的结论,在反应体系(3ml)为100mM乳酸钠缓冲液(pH4.5),偶氮染料1mM,以及根据之前优化的能得到最大酶活的Mn2+(1.6mM),H2O2(0.15mM),MnP(0.42ml)的情况下,两种染料金橙G,刚果红在1h内达到的最大脱色率都接近35%。(4)锰过氧化物酶(MnP)基因保守序列克隆体系的优化。使用NCBI搜索MnP蛋白质序列,利用GeneBank中的BLAST功能比较各种锰过氧化物酶的蛋白质保守区域,选择MnP蛋白质保守序列为PFDSTP和GGGADGS,根据蛋白质保守序列设计的简并引物：上游,5’GGNGGNGGNGCNGAYGGNTC 3’,下游,5’NGGNGARTCRAANGG 3’。利用蜗牛酶法提取裂褶菌F17基因组,并以裂褶菌F17基因组为模板进行PCR扩增。反应体系为：模版1ul,10×PCR buffer 2.5 u1,25mmol/L MgCl2 1.5μl,10mmol/L dNTPs 2μl,上游引物1μl,下游引物1μl,Taq酶0.5μl,灭菌水15.5μl,反应条件为：94℃预变性4min,94℃30s,55℃30s,72℃60s循环30次,最后在72℃延伸10min。DNA片段经过回收纯化和检测,得到573bp的MnP保守碱基序列。