论文部分内容阅读
昆虫变态发育受蜕皮激素(20E)和保幼激素(JH)的协同调控,涉及大量基因的上调或下调表达。二化螟(Chilo suppressalis)属鳞翅目螟蛾科,为杂食性的重要农业害虫,给水稻生产造成了巨大损失。目前,二化螟防治主要依赖于化学农药,导致田间抗药性持续上升,防治效果下降,杀虫剂的过度利用还导致不同程度的环境污染。深入了解二化螟发育的基因调控机制,对开发更加高效安全的二化螟防控新方法具有重要的参考价值。因此,本论文针对二化螟化蛹、蛹期发育和羽化,选择7个不同发育时期的同一批试虫样本,同时检测了蛋白编码基因和miRNA基因的表达,研究了相关基因在化蛹和蛹基因发育中的功能,结果如下:一、二化螟蛹期蛋白编码基因的表达谱分析利用Illumina Solexa技术对二化螟不同发育时期的混样进行转录组测序,采用Trinity软件对转录组进行拼接,Blastx注释后获得22,197个蛋白编码基因的转录本。分别选取老熟幼虫、预蛹、早期蛹、复眼形成时期、跗节形成时期、蛹体拉伸时期和成虫等7个发育时间点,收集样本,分为两份,一份用于蛋白基因表达检测,另一份用于小RNA基因检测。采用Nimblegen基因芯片检测了蛋白编码基因的表达谱,利用定量PCR对9个基因的表达进行了验证,其中8个基因与芯片结果一致。分析表明,487个基因的表达量随蛹期发育不断上升,795个基因随发育下调。共有622个基因在不同发育时期差异表达,可分为6种表达模式:在老熟幼虫、早期蛹、复眼形成时期和跗节形成时期分别有79、70、154和79个基因差异高表达,在老熟幼虫-预蛹-早期蛹时期有182个基因差异高表达,而蛹体拉伸-成虫时期有58个基因差异高表达。功能富集分析发现,在老熟幼虫-预蛹-早期蛹时期高表达的基因主要为物质和能量代谢相关基因,在复眼形成时期和蛹体拉伸-成虫期高表达的主要为信号转导、细胞内容物、发育过程相关基因,在化蛹和早期蛹时期差异高表达的主要为激素相关基因。结果显示,不同时期差异高表达的基因与各个时期的发育特征密切相关。二、差异高表达的SLC22A1基因在二化螟蛹期发育中的功能分析在6种表达模式中,在不同时期差异表达倍数最高的基因分别为:1)老熟幼虫时期,酪氦酸酶(tyrosinase);2)老熟幼虫-预蛹-早期蛹,胰脂肪酶甘油三酯(pancreatic triacylglycerol lipase);3)早期蛹,溶质载体家族 22 成员 1(solute carrier family 22 member 1,SLC22A1);4)复眼形成时期,Domon结构域包含蛋白(DOMON domain-containing protein);5)跗节形成时期,表皮蛋白 19(cuticle protein 19);6)蛹体拉伸-成虫期,溶质载体家族2(solute carrier family 2)。分别对这6个基因进行了 RNA干扰,除SLC22A1基因外,其他5个基因未能观察到明显的表型变化。SLC2241基因被干扰后24h,mRNA表达水平下降至43.8%(T-test,P<0.05),处理组88.9%的个体显示出不同程度的蛹表皮着色和骨化缺陷,该表型与地中海实蝇白蛹突变株系相似。分析认为,SLC22A1可能参与NADA和NBAD从血淋巴到表皮细胞的转运。分析发现,在622个差异表达基因中,共有溶质载体家族基因27个,分别属于SLC2A,SLC16A,SLC22A,SLC26A,SLC27A,SLC30A,SLC36A 和 SLC46A,以及Orct2 和Orct-like亚家族,表明SLC基因家族可能广泛地参与调控二化螟的化蛹、蛹期发育和羽化行为。三、二化螟miRNA基因的预测发现和表达谱分析收集二化螟不同发育阶段的样本,经混合后提取小RNA,构建小RNA文库,利用Illumina Solexa技术进行测序,预测发现了 103个保守和197个非保守的微小RNA基因(miRNA)。利用LC science的μParafloTM基因芯片平台,检测了二化螟miRNA基因在老熟幼虫、预蛹、早期蛹、复眼形成时期、跗节形成时期、蛹体拉伸时期和成虫等7个发育时间点的表达情况(样本收集如上所述)。结果表明,54个miRNA基因在不同发育时期差异高表达。其中,表达信号值大于500的21个差异表达miRNA中,老熟幼虫、预蛹、早期蛹、复眼发育时期、蛹体伸长时期和成虫期分别有5个,4个,1个,4个,1个和6个miRNA。对10个miRNA的表达量进行了定量PCR验证,其结果均与小RNA基因芯片一致,分别为:1)随发育逐渐下降:csu-miR-275和 csu-miR-6094;2)先下降后上升:csu-miR-34 和 csu-miR-281-5p;3)先上升后下降:csu-miR-263a、csu-miR-2779 和 csu-novel-193;4)逐渐上升:csu-miR-14、csu-miR-277和 csu-miR-989a。通过基因组和转录组数据分析,获得二化螟蛋白编码基因的3’UTR。然后,利用miRanda软件对差异表达的miRNA基因进行了靶标预测,共得到2,116个靶标基因。对这些靶标基因进行KEGG富集分析发现,在早期蛹时期受miRNA基因调控的蛋白编码基因主要为氦基酸代谢、聚糖的生物合成和代谢、碳水化合物代谢等3个通路中的基因,表明在蛹发育早期中物质和能量相关通路被miRNA抑制。四、Csu-miR-277、csu-miR-6094 和 csu-miR-275 等 miRNA 的功能分析分别选择 Csu-miR-277、csu-miR-6094 和 csu-miR-275 等三个 miRNA 基因进行功能分析。Csu-miR-277在蛹发育中期表达量开始上升并在成虫期达到最高峰,在老熟幼虫期注射csu-miR-277 mimics,发现30%的试虫提前化蛹,没有预蛹期或预蛹期明显缩短。在复眼形成时期注射inhibitor,试虫正常羽化,分别在48小时和72小时对蛹进行解剖观察,未观察到明显的表型变化。成虫盘生长因子(Imaginal disk growth factor,IDGF)被预测为csu-miRNA-277的靶标,其表达从老熟幼虫到成虫呈下降趋势,与csu-miRNA-277的表达呈负相关(T-test,P<0.05)。克隆了 Csu-IDGF基因的序列全长,为2,126 bp,CDS区长1,326 bp,编码441个氦基酸,完整的3’UTR长781 bp。利用双荧光素酶报告基因载体系统进行了靶标验证,证实了 csu-miRNA-277能够负调控Csu-IDGF基因。Csu-miR-6094和csu-miR-275基因均在老熟幼虫期高表达,在幼虫4龄第2天注射mimics,处理组和对照组没有明显的表型差异,表明这些miRNA可能只具有微调作用。五、mRNA-miRNA基因的网络调控分析由于蛋白编码基因和miRNA的表达检测采用了同一批样本,因此对mRNA和miRNA基因芯片的表达量进行了相关分析。利用二化螟3’UTR数据,对所有miRNA基因进行了靶标预测,对miRNA与其靶标基因的表达量进行了共表达分析。结果表明,表达量正相关的csu-miRNA和mRNA分别为46个和205个,发现了 8个csu-miRNA和10个mRNA的互作模块。表达量负相关的csu-miRNA和mRNA分别为39个和110个。对SLC基因家族的分析表明,SLC25A27与csu-miR-11的表达量负相关,7个SLC基因与相应的csu-miRNA呈正相关。综上所述,本文研究了二化螟老熟幼虫到成虫期间7个发育点大规模蛋白编码基因和miRNA的表达谱,并获得差异表达的基因,这些基因在化蛹、蛹期发育和羽化过程中发挥重要的作用。对两种表达数据进行了关联分析,找出正、负相关的mRNA-miRNA作用对,构建了二化螟变态发育的miRNA-mRNA的调控网络。这些为后续研究提供重要的基础。昆虫变态发育的研究可为害虫防治提供思路,20E和JH激动剂和抑制剂已经用于杀虫药剂的开发和应用,但基于基因沉默的害虫防治尚在起步阶段,本文的研究工作可为害虫治理提供理论基础和指导。