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一.研究目的和背景脑源性神经营养因子(BDNF)对神经元的生长和功能起着非常重要的作用。BDNF与TrkB受体结合以后,会引起TrkB受体的二聚化,激活其酪氨酸激酶活性,进而激活其下游的信号传导通路,磷脂酶Cγ(PLCγ)、磷脂酰肌醇-3-激酶(P13K)和细胞外信号调节激酶(Erk),实现其生物学效应。BDNF会诱使TrkB受体内吞,TrkB受体的内吞具有很重要的作用。虽然有报导BDNF诱导的TrkB内吞是一种网格蛋白以及dynamin介导的内吞(CME),但是具体的TrkB内吞分子调控机制并不是很清楚。糖原合成酶激酶30(GSK3β)在神经元中是一种非常重要的激酶,它能够影响神经元的生长以及存活。近些年的研究表明,在阿尔海默症(AD)中,GSK3β的活性异常高,这可能是导致AD的关键因素。在先前的研究中,GSK3β能够通过磷酸化dynaminl (Dynl)的第774位丝氨酸来调控一种活性依赖的内吞(activity-dependent bulk endocytosis)。所以,GSK3β能否通过磷酸化dynaminl来调控BDNF依赖的TrkB内吞,以及其在AD疾病中起着什么样的影响都具有非常大的研究价值。二.实验方法1.各种表达质粒的构建。2.原代海马神经元的培养及其转染。3.免疫荧光定量检测TrkB受体内吞。4.可裂解生物素法检测TrkB受体内吞。5.TUNNEL检测神经元凋亡。6.新奇事物认知实验和水迷宫实验。三.实验结果1.GSK3β活性调控BDNF依赖的TrkB内吞通过可裂解生物素和免疫荧光定量两种方法,我们发现过表达GSK3β的激活形式GSK3B S9A会导致TrkB内吞减少,而过表达GSK3β的失活形式GSK3B R96A会促进其内吞。2.GSK3β通过磷酸化Dynl的第774位的丝氨酸,实现对TrkB内吞的调控。通过小干扰RNA的方法干扰掉Dynl后,GSK3β不再调控BDNF依赖的TrkB内吞,证明GSK3β调控TrkB内吞是依赖Dynl的。通过查阅前人文献,发现GSK3β能够磷酸化Dynl的第774位丝氨酸。我们过表达Dynl的第774位丝氨酸模拟磷酸化形式的突变体Dyn1S774D后发现,TrkB内吞受到了抑制,并且GSK3β活性不再调控BDNF依赖的TrkB内吞。3.TAT-Dyn1SpS对于阻断GSK3β对Dynl的磷酸化作用为了研究GSK3β调控TrkB内吞的意义,我们采用一个多肽TAT-Dyn1SpS,特异性阻断了GSK3β对Dynl的磷酸化作用,并检测了其对TrkB内吞的影响,以及BDNF下游信号通路的影响。我们发现,阻断GSK3β对Dynl的磷酸化可以促进TrkB内吞,并且使得下游的Akt信号通路增强。4.A β通过GSK3β抑制TrkB内吞通过免疫荧光定量分析,我们发现Aβ能够抑制TrkB内吞,在Aβ刺激的同时加入GSK3β的抑制剂AR-A014418,或者TAT-Dyn1SpS,能够使得抑制的TrkB内吞得到部分地恢复。证明Aβ能够通过GSK3β来抑制TrkB内吞。5.TAT-Dyn1SpS能够恢复Aβ损伤的BDNF下游信号通过Aβ和TAT-Dyn1SpS同时刺激神经元,我们发现阻断GSK3β对Dynl的磷酸化能够使得Aβ造成的BDNF下游信号Akt的损失得到一定的恢复。6.TAT-Dyn1SpS能够增强BDNF对Aβ诱导的细胞凋亡的保护作用。有文献报导BDNF对Aβ诱导的细胞凋亡的保护作用,我们通过可裂解的Caspase-3的检测和TUNEL分析,发现阻断GSK3β对Dyn1的磷酸化能够增强BDNF对Aβ诱导的细胞凋亡的保护作用。7. TAT-Dyn1SpS可改善AD小鼠的学习记忆能力。在行为学的测试中,向AD小鼠的海马脑区注入TAT-Dyn1SpS与BDNF,通过新奇事物认知测试和水迷宫测试,发现TAT-Dyn1SpS能够增强BDNF对AD小鼠学习和记忆的影响。四.结论通过一系列的分子细胞学和行为学方法,我们证实了GSK3β能够通过磷酸化Dynl的774位丝氨酸调控TrkB内吞,并阐述了其生物学意义。同时,我们发现在AD中,TrkB的内吞受损。通过设计多肽干扰GSK3β对Dynl的作用,能够增强BDNF对AD的保护作用。