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目的:通过体内外模型,探讨人蛔虫提取物(body extract of Ascaris lumbricoides, BEAL)对小鼠LLC细胞株的细胞毒作用,建立小鼠LLC荷瘤模型,探讨人蛔虫提取物对肿瘤的作用及其免疫学机制。方法:1.人蛔虫提取物的制备:对蛔虫感染者一次口服双羟萘酸噻嘧啶(30mg/Kg体重),服药后从粪便中收集蛔虫成虫。取完整的蛔虫洗净后用含100U/ml青霉素、链霉素的无菌生理盐水浸泡15分钟,滤纸吸干,在超净台内解剖蛔虫,取出内脏丢弃,收集虫体,用匀浆器搅碎后,在10,000×g离心30分钟,取上清,经0.45μm醋酸纤维膜过滤除菌,用核酸蛋白分析仪测蛋白含量为3200μg/ml,置-30℃储藏备用。2.肿瘤细胞的筛选:小鼠Lewis肺癌细胞株(LLC)、小鼠肝癌细胞株(Hepa 1-6)和小鼠淋巴瘤细胞株(EL4)均购自中国科学院上海细胞研究所细胞库。用四氮唑盐酶还原法(microculture tetrazolium test, MTT)检测人蛔虫提取物对三种肿瘤细胞的细胞毒作用,以筛选出最敏感细胞株和最佳作用浓度。3.绘制LLC细胞生长曲线:取对数生长期的LLC细胞常规消化,用RPMI- 1640+10%FCS培养液调整细胞密度为1×105/ml,将细胞分别接种于24孔培养板中,1ml/孔,置37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。每天取三孔细胞进行消化后计数,取平均值,连续观察7d。其余细胞隔2d换液,根据所得数据绘制细胞生长曲线。4. LLC细胞毒性实验:取对数生长期的LLC细胞消化后,用RPMI1640+10%FCS的培养液调整细胞密度为1×105/ml,加入96孔板,100μl/孔,置37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24h,弃去孔内液体,加入不同浓度的BEAL(起始浓度为3200μg/ml的BEAL倍比稀释至12.5μg/ml),每个浓度3个复孔,置37℃、5%CO2的细胞培养箱中分别培养24h、48h、72h。弃去孔内液体,加入MTT,置37℃、5%CO2的细胞培养箱中。4h后取出,加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO),置酶标仪检测OD492,取细胞存活率≥50%的BEAL浓度为诱导实验的起始浓度。5.荷瘤小鼠模型的建立:将LLC细胞株扩增后对小鼠进行肿瘤造模:以细胞密度为1×107/ml,0.1ml/只,接种于小鼠右前肢腋下皮下。6.实验分组:A组-人蛔虫提取物事先干预组(BEAL+LLC):腹腔注射浓度为100μg/ml的BEAL,0.1ml/只,隔天一次,10d后肿瘤造模;B组-生理盐水事先干预组(NS+LLC):腹腔注射生理盐水,0.1ml/只,隔天一次,10d后肿瘤造模;C组-肿瘤造模后提取物干预组(LLC+ BEAL):以细胞密度为1×107/ml的LLC细胞悬液,0.1ml/只,接种于小鼠右前肢腋下皮下,2d后用BEAL干预,隔天一次;D组-肿瘤造模后生理盐水干预组(LLC+NS):以细胞密度为1×107/ml的LLC细胞悬液,0.1ml/只,接种于小鼠右前肢腋下皮下,2d后用生理盐水干预,隔天一次;E组-阴性对照组,正常饲养,不加任何处理。10d后处理各组小鼠进行实验。7.巨噬细胞的分离和培养:常规无菌状态(详细见下文)制备小鼠巨噬细胞,加入含有100U/ml青霉素、链霉素、10%FCS的RPMI1640培养液,调整细胞密度为1×106/ml,收集于24孔培养板中,置37℃、5%CO2培养箱中培养。8.脾淋巴细胞的分离和培养:常规无菌状态制备小鼠脾细胞,加入含有100U/ml青霉素、链霉素、10%FCS的RPMI1640培养液,调整细胞密度为1×106 /ml,收集于6孔培养板中,置37℃、5%CO2培养箱中培养。9.细胞因子的表达:巨噬细胞和脾淋巴细胞培养72h后收集上清,用ELISA法检测各实验组培养上清中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10的表达。10. LLC细胞有丝分裂指数:普通光学显微镜下观察有丝分裂相细胞,取细胞数多、中、少3个区域各一区,共计数1 000个细胞,计算出细胞有丝分裂指数(mitotic index, MI)。11.胸腺和脾脏指数:人蛔虫提取物干预荷瘤小鼠,10d后取出小鼠胸腺、脾脏称重(mg),分别除以小鼠体重(g),得到胸腺指数和脾脏指数。12.统计学分析:用SPSS13.0处理各组实验数据,对上述实验结果进行统计学分析。实验结果以均数±标准差(x_±S)表示。细胞毒实验数据转化为细胞杀伤率后采用方差分析(F检验),HE染色计算细胞分裂指数所得数据做平方根反正弦转换,然后进行方差分析。ELISA数据直接进行方差分析,样本均数的两两比较用q检验。P<0.05表示有显著性差异,P>0.05表示无显著性差异。结果:1.肿瘤细胞的筛选: MTT实验结果显示,BEAL对LLC、Hepa 1-6和EL4三种肿瘤细胞均有细胞毒作用,但以LLC细胞最为敏感,根据实验结果选取LLC为本实验的靶细胞株。2.细胞生长曲线:LLC细胞从第3d开始进入对数生长期,在第4d生长最为旺盛,之后增殖减慢逐渐进入平台期。3. LLC细胞毒性实验:当BEAL浓度为200μg /ml时细胞存活率为51%,因此取200μg /ml为诱导LLC细胞的浓度上限。4. LLC细胞有丝分裂指数:显微镜下观察,各实验组LLC细胞分裂指数均低于阴性对照组。在同一时间段内,细胞分裂指数随BEAL的浓度增加而降低,25μg/ml组的细胞分裂指数最高,800μg/ml浓度组的分裂指数最低,在同一浓度内,细胞分裂指数随时间延长而降低。5. BEAL对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响:所有分组中小鼠荷瘤后BEAL干预的C组抑瘤率最强,为33.33%,肿瘤明显小于同时干预的D组(P<0.05);BEAL提前干预的A组肿瘤明显大于B组,但A组与B组比较无明显抑瘤作用;小鼠瘤重的两两比较显示,A组与B、C、D组比较均有显著性差异,C组与D组比较也有显著性差异,其余组间两两比较无显著性差异。6.胸腺和脾脏指数:(1)胸腺指数:A组和B组均高于阴性对照的E组,其中B组与E组比较有显著性差异,A组低于B组,且有显著性差异;C组和D组均低于阴性对照的E组,但无显著性差异,C组高于D组,无显著性差异。(2)脾脏指数:A组和B组均高于阴性对照的E组,A组与E组比较有显著性差异,A组高于B组且有显著性差异;C组与D组均高于E组,C组与E组比较有显著性差异,C组高于D组但无显著性差异。7. DNA琼脂糖凝胶电泳:经BEAL诱导后的LLC细胞,其DNA经琼脂糖凝胶电泳出现具有凋亡特征的“梯状”条带,而对照组未见此现象。8. ELISA检测:(1)腹膜巨噬细胞培养上清中A、B、C、D组的TNF-α含量均低于E组,但无显著性差异;A、B、C、D组的IFN-γ含量均低于E组;A组的IL-4含量高于E组,但无显著性差异,B、C、D组的IL-4含量均低于E组,且有显著性差异。A、B、C、D组的IL-10含量均低于E组。(2)脾淋巴细胞培养上清中,A、B、C、D组的TNF-α含量均低于E组;A组的IFN-γ含量明显高于E组,有显著性差异,其它各实验组与E组比较均无显著性差异;A、B、C、D组的IL-4含量均低于E组,与E组比较有显著性差异;A组的IL-10含量明显高于E组,有显著性差异。结论:1.BEAL能够对体外培养的LLC产生细胞毒作用,并能够诱导其发生凋亡。BEAL对细胞的抑制率在一定范围内呈浓度和作用时间依赖性,在同一时间段内当BEAL浓度增加时,抑制率升高;在同一浓度下随BEAL作用时间的延长,抑制率也增加。2.BEAL可降低LLC有丝分裂指数,影响细胞周期,提示BEAL可降低肿瘤细胞活力,抑制肿瘤细胞的增殖。3.通过荷瘤小鼠模型,发现BEAL影响了肿瘤的形成,在一定条件下具有明显的抑瘤作用。4. BEAL影响了荷瘤小鼠的免疫器官(胸腺和脾脏)指数,提示一定浓度的BEAL有可能促使小鼠增强其机体免疫的功能。5. BEAL对荷瘤小鼠巨噬细胞和脾淋巴细胞分泌细胞因子产生了干扰,提示有Thl/Th2细胞的失衡。