视网膜疾病占重症眼病的一半以上，其中既有先天性视网膜缺损，如视网膜色素变性，也有后天因为外伤或其他疾病产生的视网膜并发症，如普通强光或激光造成的视网膜光损伤、糖尿病并发的眼病等。目前对于较轻的视网膜损伤主要采取抗炎治疗或营养因子治疗，而对重度损伤尚无很好的治疗方法，主要是玻璃体止血、促进凝血的吸收。许多病例因未能及时治疗或无药可救而导致视力下降甚至失明，因此寻找更好的治疗方法对于治疗视网膜疾病至关重要。 干细胞工程的研究为视网膜损伤的治疗提供了一种新的途径。研究者试用了多种干细胞，以期解决视网膜损伤的修复问题，如胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)、胚胎视网膜祖细胞、成体哺乳动物眼干细胞等。但都存在着各种缺陷，如异体移植问题、伦理学问题及取材问题等。 骨髓中含有可分化为外周循环血细胞的造血干细胞早已为人所知。此外，人们还发现骨髓中有一群细胞可以分化成多种间质样的细胞，于是将它们称为骨髓间充质干细胞(即Mesenchymal Stem Cells，MSC)。在体外不同条件的作用下MSC可以定向地被诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、肌腱细胞、神经元等不同的细胞。MSC取材相对较容易，来源丰富，体外增殖能力强，适于作为细胞供体进行自体移植。 鉴于MSC便利的取材及其可向神经细胞分化的潜能，本研究期望通过视网膜下移植的方式研究MSC在正常视网膜及激光损伤视网膜中分化为视网膜的可能性，以及分化成的细胞是否具有神经细胞的特性，是否有利于视网膜激光损伤后的组织修复及视功能的恢复。 本研究首先分离、培养并鉴定了MSC。利用骨髓间充质干细胞的密度特性，用一定密度的Percoll对骨髓进行密度梯度分离，再利用骨髓间充质干细胞粘附在培养皿上的特性，去除单核／巨噬细胞，从而达到富集骨髓间充质干细胞的目的，体外传代可达15代以上。对富集纯化的细胞进行流式细胞术表型鉴定，并将MSC诱导分化为脂肪细胞，证明了其具有多向分化能力。自行建立的培养方法已申请 军事医学利学院博}学位论文专利(专利受理号01141865.6)。如此培养出的MSC既具备增殖快的特点，又保持了其做为干细胞的多向分化潜能，为进一步研究工作扫一下基础。 为证实MSC可以在正常视网膜分化为视网膜结构，本研究首先分离培养了雄性大鼠的MSC，将其移植到雌性大鼠视网膜下，4周后利用雌雄标记法进行Y染色体原位杂交，示踪MSC的分布。光学显微镜观察结果显示，阳性细胞在移植区域周围与原来的视网膜细胞融合，并形成了典型的内、外核层及节细胞层的细胞形态。同一视野下同时存在着阳胜和阴性细胞，阳性细胞并非单独存在，而是形成一定的阳性细胞群，中间夹杂着阴性细胞。其中以外核层的阳性细胞较多，由外到内逐渐减少，节细胞层最少。整个视网膜形态平滑，未见到玫瑰花结结构少巨成。 一证明MSC在视网膜卜的分化至少需要3种示踪方法，因此本研究采用了体外经AAV一加感染MSC的视网膜下移植观察。荧光显微镜观察结果表明，移植4周后发现视网膜内存在GFP阳性细胞，其中以视网膜色素上皮层、视细胞层为多，内、外网状层及节细)泡层也有}朴胜细胞的存在。阳性细胞相对较聚集，夕手与阴性细胞相融合，在光学显微镜卜‘末发现视网膜形态的异常。这一结果不仅说明MSC在视网膜下分化的定位，也说明MSC司一以被AJ叭z所感染，司一以作为基因修饰细胞移植的载体细胞。AAV一gfr感染的结果与Y染色体原位杂交结果基木一致。 以__}二不沙}究只观察了4周时MSC的变化情况，为观察MSC在移植后不同时问的变化过程，同时用另一种方法再次确证MSC在视网膜下的存在，本研究进一步采用荧光染料DAPJ对MSC进行标记，分别于移植后10、20、35和50天观察了视网膜MSC一DAPI的分布情况。MSC在正常视网膜分化有以下特点:①卜lIJ卜l-细胞随着移植时间的延长，先是顺着移植部位向周围打、一展，阳性细胞所在的部位不断扩大，而后又有缩小的趋势，50大观察到的卜卜}胜细胞范围比35大明显绷小(阳性红l!胞4个时I泊」点分布范围分别为960‘:n飞、1280抖m、640工Lm及160牛tm)，这说明MSC的分化增殖是受到调控的，不会无限制增生;而且在正常视网膜条件下似乎存在着一种抑制机制，使MSC趋向于逐渐减少;②阳性部位的细胞分布第4臾共127军事队学利学院博卜学位论文较特殊:有的外核层阳性在外核层的最外层，内核层阳性在内核层的最内层。③观察到50天为止，米发现DAPI阳性细胞参与或导致视网膜的增生，也未发现细胞层的增厚一。 前一部分工作发现了MSC可以在视网膜下存在，并示踪了其变化过程。那么形成的视网膜样结构是否具有视网膜各层的细胞特征呢?本研究对以上各时间点的MSC一DAPI冰冻切片进行了神经特异胜蛋白NeuN及NSE、字中经胶质细胞特异性蛋白GFAP及视网膜色素上皮标志CK的兔疫组化染色。结果表明卜[I性细胞在移植之初己经有部分细胞表达了Ne、lN和NSE等神经细胞表面标志，同时也观察到G队P和CK在视网膜的?