黄酮醇,又名3-羟基黄酮,在黄酮类化合物中最常见并且分布最广泛,通常以糖基化形式存在,具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、预防心血管疾病和糖尿病、保护神经系统等药理学活性,在食品、化妆品、生物医学等方面有着广泛的应用,因此其开发利用价值较高。目前制备黄酮醇的主要途径有植物有机溶剂提取法、化学合成法以及微生物发酵法。有机溶剂提取法具有耗时耗力、有机溶剂使用量大和植物材料来源受限制等缺陷。化学合成法需要用到毒性试剂,具有反应复杂、条件苛刻、副产物多、分离纯化困难等不足。微生物发酵法相比于前两种方法,具有成本低廉、易于放大生产、产量相对较高、产物易纯化等优势。但是,由于细胞系统的复杂性、人工合成元件与宿主的不相容性、目标产物对宿主细胞的抑制作用和系统的不稳定性,导致并非所有的工程菌都能生产目标化合物分子。本研究旨在建立一种体外酶促合成黄酮醇的方法,以克服上述三种方法的弊端。首先,设计了一条以黄烷酮为底物,在黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄酮醇合酶(FLS1)的催化作用下生成黄酮醇的合成途径,并利用本课题组保存的重组质粒诱导表达、亲和纯化了重组蛋白,SDS-PAGE电泳显示其纯度高达90%以上。然后,在体外建立了 F3H和FLS1酶活性的检测体系,通过聚酰胺薄层色谱和高效液相色谱质谱联用仪检测了 F3H和FLS1反应的产物,比较了黄豆和拟南芥来源的F3H和FLS1的酶活性。发现拟南芥F3H和FLS1的酶活性高于黄豆F3H和FLS1的酶活性,且His-AtF3H和His-AtFLS1在30 ℃条件下的米氏常数分别为0.081±0.025 mM和0.072±0.052 mM。接着,建立了黄酮醇的体外酶促合成体系,并以柚皮素为底物在体外成功合成了山奈酚。优化后的反应体系含有0.1 MTris-HC1(pH7.2)、0.4%抗坏血酸、10%甘油、8.2mMα-酮戊二酸、0.01 mM亚铁离子、0.5 mM柚皮素以及His-AtF3H和His-AtFLS1融合蛋白各25μg/mL。最适反应温度为40 ℃,最佳反应时间为40 min,转速为600 rpm。优化后的产量为37.55±1.62 mg/L,是优化前的1.88倍,底物转化率为55.89%±2.74%。最后,以0.35 mM圣草酚和0.5 mM乔松素为底物,利用这一体外酶促合成体系分别成功合成了槲皮素和高良姜素。圣草酚转化成槲皮素的转化率为62.85%±0.48%,产量为25.56±0.38 mg/L。乔松素转化成高良姜素的转化率为13.58%±0.60%,产量为0.58±0.01 mg/L。综上所述,本研究建立了一种体外酶促合成黄酮醇的新方法,为黄酮醇的制备提供了一条新的途径,有利于此类分子在生物医药、食品和保健品等行业的广泛应用,也为其它次生代谢产物的开发利用提供了一条新的思路。