目的探究长期服用寒痹停片及制马钱子粉是否会引起马钱子碱与士的宁在正常大鼠及佐剂关节炎大鼠体内的蓄积,及寒痹停片复方配伍对马钱子粉中的马钱子碱与士的宁的药动学是否存在影响,同时测定大鼠肝脏CYP450酶的含量,以初步探讨寒痹停片复方制剂及制马钱子粉对大鼠代谢的影响,为寒痹停片的临床安全、合理用药提供科学依据。方法1.寒痹停片中马钱子碱与士的宁在健康大鼠体内多次给药的药动学研究。Wistar大鼠24只,雌雄各半,分为空白对照组、寒痹停片组和制马钱子粉组,每组8只,给药组根据临床上寒痹停片成人单次口服剂量及人与动物间的等效剂量换算,分别按寒痹停片0.1386g·kg^-1、制马钱子粉6.93mg·kg^-1(按士的宁计为1.1mg·kg^-1)的剂量灌胃给药,每天给药3次,连续灌胃7天。自第3天开始,每天于第二次灌胃给药后300min眼眶静脉采血,第7天早上灌胃给药后5、10、20、30、45、60、90、120、180、300、420、540、720min眼眶静脉取血,采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS法测定大鼠各时间点血浆中马钱子碱与士的宁的血药浓度,DAS3.0软件计算马钱子碱与士的宁的药动学参数,利用SPSS22.0软件对所得的主要药动学参数进行统计分析。2.寒痹停片中马钱子碱与士的宁在佐剂大鼠体内多次给药的药动学研究。（1）造模随机取Wistar雄性大鼠50只,在其右后足跖部注射弗氏完全佐剂0.1mL致炎,于致炎前及致炎后第1、3、5、7、9、11、13、15天测定大鼠左右足跖部体积,观察大鼠关节红肿程度及毛色变化,计算足跖肿胀率、关节炎指数,初步判断造模是否成功。于第15天经眼眶静脉取血后,离心,取血清,经ELISA法测定血清中IL-1β、TNF-α含量,再次验证造模是否成功。（2）分组将造模成功的大鼠随机分为模型对照组、寒痹停片临床剂量组、寒痹停片高剂量组、制马钱子粉临床剂量组、制马钱子粉高剂量组,每组8只。（3）给药与取血临床剂量组按寒痹停片0.1386g·kg^-1、制马钱子粉6.93mg·kg^-1(按士的宁计为1.1mg·kg^-1)的剂量灌胃给药,高剂量组按寒痹停片1.0452g·kg^-1、制马钱子粉0.1534g·kg^-1(按士的宁计为12mg·kg^-1)的剂量灌胃给药,每天给药3次,连续灌胃7天。自第3天开始,每天于第二次灌胃给药后300min眼眶静脉采血,第7天早上灌胃给药后5、10、20、30、45、60、90、120、180、300、420、540、720min眼眶静脉取血。（4）血药浓度测定及数据处理采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS法测定大鼠各时间点血浆中马钱子碱与士的宁的血药浓度,DAS3.0软件计算马钱子碱与士的宁的药动学参数,利用SPSS22.0软件对所得的主要药动学参数进行统计分析。3.寒痹停片及制马钱子粉对大鼠肝脏CYP450酶的影响。取上述1、2部分灌胃给药后第8天的大鼠,称重后腹腔注射10%水合氯醛麻醉,剖开腹腔,迅速取出肝脏,放于冰冷的生理盐水中冲洗干净,滤纸吸干水分,称重,计算各组大鼠的肝脏指数。再将肝脏剪碎,用pH7.5的TMS缓冲液制成20%（w/v）的匀浆,再用低温高速离心机（10⁴×g）离心15min,取上清液加入88mmol·L^-1的氯化钙溶液,使其终浓度为8mmol·L^-1,稍搅拌混合,放冰浴5min,高速离心机27000×g离心15min,取沉淀重悬于TMS缓冲液中,用ELISA试剂盒测定肝微粒体在450nm波长下的吸光度,通过标准曲线计算大鼠肝脏中CYP450酶的浓度。结果1.寒痹停片中马钱子碱与士的宁在正常大鼠体内多次给药的药动学研究。寒痹停片及制马钱子粉中马钱子碱与士的宁在大鼠给药3天后血药浓度达到稳态。末次给药后,寒痹停片中马钱子碱和士的宁的主要药动学参数分别为:T_1/2为4.56、3.32h,T_max为0.43、1.57h,T_1/2Ka为1.17、3.05h,Ka为11.54、3.70h^-1,C_max为6.04、38.17ng·L^-1,AUC_0→t为23.17、534.33ng·h·L^-1,CL/F为25038.89、6226.80L·h^-1·kg^-1;制马钱子粉中马钱子碱和士的宁的主要药动学参数分别为:T_1/2为5.87、3.73h,T_max为0.66、1.04h,T_1/2Ka为4.57、9.88h,Ka为3.31、2.59h^-1,C_max为1.31、22.07ng·L^-1,AUC_0→t为45.43、376.63ng·h·L^-1,CL/F为61028.54、16162.44L·h^-1·kg^-1。经SPSS统计软件分析,与制马钱子粉相比,寒痹停片中马钱子碱的清除率显著降低。2.寒痹停片中马钱子碱与士的宁在佐剂大鼠体内多次给药的药动学研究。寒痹停片及制马钱子粉的临床剂量和高剂量组,马钱子碱与士的宁在大鼠给药3天后血药浓度均达到稳态。末次给药后寒痹停片临床剂量组中马钱子碱与士的宁的主要药动学参数为:T_1/2为2.23、3.35h,T_max为0.23、1.25h,T_1/2Ka为1.73、2.30h,Ka为0.44、0.37h^-1,C_max为44.64、324.92ng·L^-1,AUC_0→t为490.6、6336.5ng·h·L^-1,CL/F为113456、13026L·h^-1·kg^-1;制马钱子粉临床剂量组中马钱子碱与士的宁的主要药动学参数为:T_1/2为2.34、2.64h,T_max为0.56、0.56h,T_1/2Ka为1.50、1.89h,Ka为0.60、0.46h^-1,C_max为17.38、165.89ng·L^-1,AUC_0→t为190.1、2035.1ng·h·L^-1,CL/F为313853、104873L·h^-1·kg^-1;寒痹停片高剂量组中马钱子碱与士的宁的主要药动学参数为:T_1/2为3.09、2.96h,T_max为0.95、0.87h,T_1/2Ka为1.06、1.22h,Ka为0.86、0.66h^-1,C_max为232.97、626.74ng·L^-1,AUC_0→t为1826.6、4382.5ng·h·L^-1,CL/F为3786738、2156109L·h^-1·kg^-1;制马钱子粉高剂量组中马钱子碱与士的宁的主要药动学参数为:T_1/2为1.14、1.67h,T_max为0.37、0.54h,T_1/2Ka为0.74、0.91h,Ka为1.13、0.84h^-1,C_max为124.36、532.51ng·L^-1,AUC_0→t为659.9、3437.3ng·h·L^-1,CL/F为1893384、267919L·h^-1·kg^-1。经SPSS统计软件分析,以制马钱子粉为参照,临床剂量组中寒痹停片中马钱子碱的C_max极显著增加;高剂量组中寒痹停片中马钱子碱的T_1/2、T_max极显著延长,AUC_0→t显著增加,士的宁的T_1/2显著延长。3.在临床给药剂量下,佐剂大鼠与健康大鼠相比,寒痹停片和制马钱子粉中马钱子碱的T_1/2是健康大鼠的0.49、0.40倍,CL/F是4.53、5.14倍,AUC_0→t是21.17、4.18倍,Ka是0.04、0.18倍,T_1/2Ka是1.48、0.33倍,T_max是0.53、0.85倍,C_max是7.39、13.27倍;士的宁的T_1/2是健康大鼠的1.01、0.71倍,CL/F是2.09、6.49倍,AUC_0→t是11.86、5.40倍,Ka是0.1、0.18倍,T_1/2Ka是0.75、0.19倍,T_max是0.80、0.54倍,C_max是8.51、7.52倍。经统计学软件分析,寒痹停片中马钱子碱的T_1/2、Ka、T_max与健康大鼠相比显著降低,两种药物中的马钱子碱与士的宁的C_max与AUC_0→t极显著增加,CL/F显著加快。4.寒痹停片及制马钱子粉对大鼠肝脏CYP450酶的影响。健康大鼠:大鼠灌胃给予寒痹停片与制马钱子粉后,肝指数分别为3.67、3.61,空白对照组为3.35;肝脏CYP450酶含量分别为0.1720、0.1558ng·ml^-1,空白对照组为0.1438ng·ml^-1。其中,与空白对照组相比,寒痹停片与制马钱子粉组肝指数显著增加,肝脏CYP450酶含量虽也有所增加,但差异无显著性。而寒痹停片组与制马钱子粉组间肝指数与肝CYP450酶含量均无显著性差异。佐剂性大鼠:临床剂量下,寒痹停片与制马钱子粉的肝指数分别为3.15、3.14,模型对照组为3.11;肝脏CYP450酶含量分别为0.1533、0.1567,模型对照组为0.1480。高剂量下,寒痹停片与制马钱子粉的肝指数分别为3.40、3.39;肝脏CYP450酶含量分别为0.1679、0.1581。与模型对照组相比,寒痹停片与制马钱子粉在两种剂量下肝指数均有所增加,但高剂量增加幅度更大,而肝CYP450酶含量在临床剂量与高剂量下,与模型组相比,均无显著性差异。寒痹停片组与制马钱子粉组之间,肝指数与CYP450酶含量均无显著性差异。结论1.寒痹停片及制马钱子粉中马钱子碱与士的宁在健康大鼠体内多次给药的药动学过程符合一房室模型。寒痹停片复方配伍可使制马钱子粉中马钱子碱的清除率显著降低,说明寒痹停片复方配伍对制马钱子粉中马钱子碱的体内消除过程有影响。给药3天后,寒痹停片及制马钱子粉中马钱子碱与士的宁的血药浓度均达稳态,并未出现随着给药时间的延长,血药浓度持续增加的现象。提示临床给药剂量下,长期给予寒痹停片及制马钱子粉不会引起毒性成分在正常大鼠体内蓄积导致血药浓度的持续叠加升高,引起中毒现象发生的可能。2.寒痹停片及制马钱子粉不同给药剂量下,马钱子碱与士的宁在佐剂大鼠体内多次给药的药动学过程均符合一房室模型。各组中的马钱子碱与士的宁的血药浓度在给药3天后均达稳态,没有出现随着给药次数的增加血药浓度升高,大鼠死亡的现象。提示在非致死剂量下,长期给予寒痹停片及制马钱子粉不会引起毒性成分在佐剂大鼠体内蓄积导致血药浓度的持续叠加升高,引起中毒现象发生的可能。寒痹停片与制马钱子粉相比,在临床剂量下,马钱子碱的吸收极显著增加;高剂量下,马钱子碱的吸收速度极显著加快,吸收量显著增加,马钱子碱与士的宁的消除速度显著加快。提示寒痹停片复方配伍可促进制马钱子粉中马钱子碱的吸收,剂量越高,配伍因素对马钱子碱与士的宁吸收与消除的影响越大。3.在临床给药剂量下,佐剂大鼠与健康大鼠相比,C_max与AUC_0→t均极显著增加,CL/F显著加快。提示在病理状态下,寒痹停片及制马钱子粉中的马钱子碱与士的宁在大鼠体内的吸收可极显著增加,消除速率显著加快。4.佐剂性关节炎模型对大鼠肝脏有一定的损伤,可使大鼠的肝脏指数下降,但灌胃给予高剂量的寒痹停片及制马钱子粉后,大鼠的肝指数又恢复正常,提示药物对肝脏有一定的保护作用;在健康状态或是病理状态下,寒痹停片及制马钱子粉对大鼠肝脏CYP450酶的含量均无显著性影响,初步判定该药物对肝酶活性没有明显的影响。