基于羽叶三七复合群简化基因组的SSR引物开发及应用初探

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分子标记因其独特的优势,在物种鉴定与生物多样性研究中有不可替代的作用。其中SSR标记因其呈孟德尔遗传;共显性;具有很好的稳定性与多态性;对DNA的质量和数量要求不高等优点,在多个类群中得到广泛的开发和利用。本研究专注于羽叶三七复合群(Panax bipinnatifidus complex)的SSR引物开发和利用。该复合群隶属于人参属(Panax Linn.)五加科(Araliaceae),有一定药用价值。但因其内部存在许多根、叶、花、果实等方面的过渡性状,又经历了短期的适应辐射等,导致该复合群在人参属中的分类学范畴和地位一直存在较大争议。本研究利用29份羽叶三七复合群的改良双酶切简化基因组测序(Mi dd RAD-seq)数据进行SSR引物开发。开发出的11对引物在羽叶三七复合群22个不同分布区的66个个体中进行多态性验证并在人参属下其它三个物种三七(P.notoginseng)日本竹节参(P.japonicus)和屏边三七(P.stipuleanatus)中进行引物通用性验证。本研究开发出的SSR引物,填补了针对该复合群中多物种设计的SSR引物的空白,为其分类范学畴和地位进一步研究以及遗传多样性评价提供技术支持。主要研究结果如下:(1)利用Stacks软件包及QDD软件包对29份羽叶三七复合群个体Mi dd RAD-seq中所含有的SSR位点进行挖掘,对其在羽叶三七复合群中的分布和组成进行统计分析。本研究共获得7,458条包含完全重复型(P型)SSR位点的序列,无论是重复单元类型,重复序列长度还是重复次数,总体上都表现出与SSR位点数目负相关。在挖掘出的SSR位点中二核苷酸重复位点多于三核苷酸重复位点,其中的优势重复基序分别为AG/CT与AGC/CTG。SSR序列长度主要为10-25 bp,其中长度为12 bp的占比最多为24.48%,其次为18 bp占比21.31%。(2)根据挖掘出的SSR位点侧翼序列批量设计SSR引物,随后制定9条引物筛选标准,最终在7458条包含完全重复型(P型)SSR位点的序列中筛选出114对引物。之后,在研究群体中进行琼脂糖凝胶电泳与毛细管电泳PCR扩增,最终筛选出11对在羽叶三七复合群中扩增成功率高(97.52%),多态性好(平均每对引物扩增出6.91个等位基因)的SSR引物。最后在三七,屏边三七,日本竹节参三个物种13个个体中检测11对引物的通用性,结果表明10对引物在三个外类群物种中都成功扩增并表现出多态性,1对引物只在日本竹节参中成功扩增。其中,引物P5与P9在外类群种水平上有较高分辨率,可以分辨出三个外类群物种,引物P7在外类群个体间有较好多态性。(3)使用筛选出的11对引物对来自湖南(HN)和湖北(HB)未知分类身份的样本进行分析,发现其可能是四倍体物种,并根据聚类分析结果可处理为一个遗传单元,该遗传单元属于羽叶三七复合群但不属于羽叶三七复合群中的姜状三七或越南三七,与同为四倍体的日本竹节参相比是显著不同的遗传单元,而可能与羽叶三七复合群中其它具有竹鞭状根状茎的样本属于同一类群。(4)使用11对引物扩增数据对羽叶三七复合群22个不同分布区的66个个体进行UPGMA系统发育和STRUCTURE聚类应用。结果表明,在羽叶三七复合群中姜状三七和越南三七的单系地位得到较高支持,即11对SSR引物的综合运用可以鉴定出羽叶三七复合群下的姜状三七与越南三七。来自P.wangianus,P.bipinnatifidus两个种的样本在聚类分析中表现出种内聚成多个小支种间相互嵌套样式,但总体而言,来自P.bipinnatifidus的样本相较于来自P.wangianus的样本有更好的聚类结果。总而言之,本研究通过对29份羽叶三七复合群简化基因组数据的挖掘,从而统计了该复合群中SSR位点分布特征,并从中开发出11对SSR引物。这11对SSR引物可区分出羽叶三七复合群下的姜状三七与越南三七两个物种,并在该类群中表现出较好的多态性。其次,11对引物中有10对在人参属其余三个物种(竹节参,三七,屏边三七)中可成功扩增,有较好的跨物种扩增能力,并表现出一定多态性。在筛选引物过程中,共计28对引物在羽叶三七复合群中有信号,可丰富人参属植物SSR引物库。
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