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目的：在成功的建立体外大鼠破骨细胞培养系的基础上观察不同浓度的阿仑磷酸盐在体外实验中诱导破骨细胞凋亡的情况，并通过体内实验加以论证。 方法：实验分两组：体外实验组（细胞培养组）；体内实验组（动物实验组）。 体外实验。全骨髓细胞的提取及培养：将4周龄雄性SD大鼠乙醚麻醉，断颈处死。无菌条件下取股骨和胫骨，去净骨表面的软组织，剪断长骨两骺端，暴露骨髓腔，用10ml一次性注射器吸取10miα-MEM插入髓腔冲洗，至骨发白。收集细胞悬液，然后以1500转／分钟离心4分钟，弃去上清液，再加入40mlα-MEM吹打均匀后进行二次离心。这样洗涤细胞两次后，加入20mlα-MEM全培养液（体积分数15％新生牛血清，青霉素1000μ／ml，链霉素1000μg／ml），计算细胞数，配成2×106cell／ml的细胞悬液，注入24孔培养板0.5ml／孔和50ml培养瓶10ml／瓶，同时加入1,25（OH）2D3使其终浓度为10-8mol／l，然后放入5％CO237℃孵育箱中培养。每3天更换一次培养液，去掉3／5体积的旧培养液，换以同体积的含1,25（OH）2D3新培养液。培养至第六天时，经倒置相差显微镜和TRAP特异染色证实所培养的细胞为破骨细胞。 培养板组和对照组：培养至第6天，加入ALN，使其终浓度为10-8，10-7，10-6，10-5M，对照组给予同体积的 中文摘要磷酸缓冲液①BS)，继续培养48小时。然后，平板离心4分钟，1500转／分钟，TRAP染色，镜下计数每孔的破骨细胞数目。再滴加 Hoechest33258染液，浓度为 5 u g／tl，室温下避光放置15分钟，PBS缓冲液冲洗干净，并用滤纸吸干液体，倒置荧光显微镜下观察细胞凋亡的形态和数目。 培养瓶组和对照组：同上，培养至第6天时，加入同板中浓度一致的ALN和同体积的PBS缓冲液，培养48小时后，细胞刷轻刮瓶壁，洗涤两次，送流式细胞仪检测。用 Annexin－V和 PI结合检测凋亡的破骨细胞数目。 体内实验。给药：将3只大鼠随机分成用药组闪根骨)和阴性对照组N根骨)，按 Zing／kg ＃J量腹腔内注射ALN和 PBS连续 2日。 灌流固定及取骨：最后一次给药24小时后，2％戊巴比妥钠腹腔内注射，每只鼠注射0．4心石ml，36分钟后，待大鼠全身瘫软，进入麻醉状态，将其四肢固定，剪开胸部皮肤及皮下组织，暴露心脏，用12号针从左心室直插入主动脉，同时剪开左心耳，进行心脏灌流。先以PBS液将全身的血液冲出，然后注入固定液门．25％戊二醛，4％多聚甲醛，0．IM PBS液＊ 待大鼠全身僵直后，停止灌流。按体外实验的方法取其股骨和腔骨，然后放入固定液中，浸润固定2上小时。 脱钙：将固定好的骨标本用0．IM PBS液冲洗干净，放入PBS液中4oC冰箱过夜。第二日，将骨标本放入PH＝7．4的 5OEDM（ethylenediaminotetra acetic acid）中脱钙 2周，隔日换液一次。 2 中文摘要 制作骨切片：将脱好钙的骨标本常规梯度脱水，二甲 苯透明，浸蜡，包埋，然后将蜡块切成spin厚的组织切 片备用。 TRAP染色：石蜡切片常规脱蜡至水。在常温下，将 配好的htP染色液滴于切片上，每张3滴左右，然后放 入 5％COZ 37oC孵育箱孵育，30分钟后取出，用蒸馏水冲 洗干净。 苏木素复染：将TRAP染好的切片放入苏木素中5分 钟，盐酸－酒精分化后，二次脱水，二甲苯透明，树胶封 片。 结果：l、体外实验结果。IRAP染色结果：培养第 六天1’’vin染色，胞浆呈紫红色且伸出许多细长的伪足样 突起，细胞核多者为破骨细胞。加药后，对照组的阳性细 胞数目明显多于用药组，且胞浆丰满，内含许多空泡结构， 核仁清晰，核呈圆形或椭圆形，体积较大。而用药组不仅 细胞数目少，且细胞多胞浆皱缩，TRAP染色极深，核固 缩，核仁结构不清晰，但与正常的破骨细胞的体积大小近 似。这种形态学特征就是凋亡。相比较而言，二者在形态 上还是很好区分出来的。同时，用药组与对照组均未见到 死亡的破骨细胞。 计数各组的破骨细胞数，对照组的细胞数为203．63土 2．92，明显多于各用药组（155．50士2．69，fis．50士2．29，93．88 土1．92，79．88土232），p＜0刀1有显著性差异。且各用药组间 除 10”’M和 10－’M之间无显著性差异外，均有显著性差异， 表明破骨细胞数目随ALN的浓度增加而减少，两者有剂 量依赖性。 3 中文摘要 Hoechest 33258荧光染色结果：Hoechest 33258是一种活细胞染料，将显微镜调至WU段，在TRAP染色的背景映衬