烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是一类在自然环境中广泛存在的机会性致病真菌,主要通过无性产孢形式快速播散,可导致人和动物出现多种慢性和急性曲霉病,其中以侵袭性肺曲霉病(Invasive pulmonary aspergillosis,IPA)病情最为严重,病死率常达50%以上。近年来,由于恶性肿瘤、血液干细胞移植等易感人群增加,IPA发病率呈上升趋势,而烟曲霉则成为导致住院患者死亡的一类主要感染性病原体。唑类药物是临床治疗曲霉病最主要的一线药物,然而自1997年首次报道出现对伊曲康唑耐药的烟曲霉以后,临床和环境分离的烟曲霉对唑类药物耐药的报道不断增加,部分国家医疗机构唑类耐药烟曲霉的检出率高达10%,导致曲霉病的临床治疗变得更加困难。烟曲霉对唑类药物耐药最常见的耐药机制是羊毛甾醇14α-去甲基化酶的编码基因cyp51A出现点突变,其上游启动子区域可能同时出现一定长度的串联重复序列(tandem repeat,TR),包括TR34/L98H和TR46/Y121F/T289A等,农业唑类杀菌剂的广泛使用被认为是导致这类突变株出现和流行的最主要原因。由于目前我国临床机构曲霉病诊断率低、微生物实验室不常规开展烟曲霉的药敏实验、农业杀菌剂使用与真菌耐药性产生之间的关联研究缺乏,导致我国临床和环境烟曲霉对唑类药物耐药的流行现状和产生机制仍不清楚。本研究的主要目的是:(1)通过在我国多个地区开展临床和环境烟曲霉耐药性监测,获得烟曲霉对临床唑类药物耐药的流行情况与主要耐药机制;(2)通过对烟曲霉进行分子分型和全基因组测序分析,揭示国内外唑类药物耐药与敏感烟曲霉的遗传变异特征与进化关系;(3)通过对植物致病真菌与烟曲霉耐药特征进行比对分析以及开展唑类杀菌剂耐药表型检测和体外耐药诱导实验,揭示农业唑类杀菌剂使用对烟曲霉耐药性产生的可能影响。2014-2015年间,与位于我国不同地区的11家医院合作开展临床烟曲霉监测,经分离鉴定获得临床烟曲霉317株;从北京、上海等13个城市的医院、市内公园或农田采集392份环境标本,经真菌培养和鉴定获得环境烟曲霉144株。利用含有伊曲康唑或伏立康唑的1640培养平板对所有烟曲霉进行耐药性筛查,结果发现共有10株烟曲霉可以同时在含有伊曲康唑和伏立康唑的培养基生长,这些菌株进一步被鉴定为唑类药物耐药株(伊曲康唑或伏立康唑MIC值≥4mg/L),包括8株临床株和2株环境株。临床和环境烟曲霉总体耐药率分别为2.5%(8/317)和1.4%(2/144)。这些耐药菌株来自福州、上海、成都、北京和沈阳等5个城市。进一步对cyp51A基因突变进行检测,结果发现5株临床株携带TR34/L98H突变,2株临床株和2株环境株出现TR34/L98H/S297T/F495I突变,这些菌株均对伊曲康唑高度耐药(MIC值≥16 mg/L)。另外,我们首次在国内检出1株含有TR46/Y121F/T289A突变的对伏立康唑高度耐药(MIC值≥16 mg/L)的烟曲霉,该菌株分离自某医院患者痰液标本。该患者高度疑似出现IPA,既往没有使用唑类药物的历史,在感染发生约2周后死亡。在153株随机选取的唑类药物敏感烟曲霉中,36株(23.5%)至少含有1个位点的突变,以N248K突变最为常见。A9T、M172V/A330P和N248K/M499K突变仅在环境株检出,而D343N、I242V、K314T、D262Y、F46Y/M172V/E427K等突变仅在临床株检出。另从1株来自上海的临床株和1株来自新疆的环境株中检出一种既往报道可能与耐药相关的F46Y/M172V/N248T/D255E/E427K突变。进一步对10株唑类耐药株和153株唑类敏感株进行CSP、STR分型和Mating型别检测。CSP分型结果显示,5株TR34/L98H突变株和4株TR34/L98H/S297T/F495I分别属于t02和t04A型,而TR46/Y121F/T289A属于t01型。92株临床株共分为15个CSP型别,61株环境株共分为7个CSP型别,其中以t01、t04A和t03型最常见。Mating型别检测结果显示,4株TR34/L98H/S297T/F495I突变烟曲霉属于MAT1-2型,而其他6株耐药株为MAT1-1型。153株敏感株中MAT1-1和MAT1-2型菌株分别有87株(56.9%)和66株(43.1%)。对我国163株唑类耐药和敏感烟曲霉进行STR分型分析结果显示,临床和环境烟曲霉均呈散在分布,8株唑类耐药株属于一个大的聚类分枝,这个簇群占所有被调查菌株的49.1%。来自成都的1株TR34/L98H突变型烟曲霉与其他烟曲霉遗传距离较远,而TR46/Y121F/T289A突变型烟曲霉则属于另一个主要由敏感环境株构成的聚类分枝。整理获得文献报道的836株烟曲霉STR分型信息,结合本研究163株烟曲霉分型结果进行综合分析,发现大部分TR34/L98H突变株和TR46/Y121F/T289A突变株分布在其中一个主要克隆簇群,来自印度的许多TR34/L98H突变株具有相同的STR型别,提示存在克隆播散的可能。本研究分离的TR46/Y121F/T289A突变株与来自荷兰临床或环境标本的相同突变烟曲霉具有较近的遗传背景。我国分离的TR34/L98H/S297T/F495I突变性烟曲霉与其他各类唑类药物耐药株之间的STR分型差异较大。利用Illumina公司的Miseq 600测序仪,对本研究收集的18株烟曲霉进行全基因组测序,与荷兰、英国和印度等3个国家的基因组测序数据进行比较分析,构建基于SNP的烟曲霉进化树,结果显示本研究鉴定的5株TR34/L98H突变株中有4株与荷兰、英国和印度等3个国家的耐药突变株共同被分入一个大的进化枝,而本研究鉴定的4株TR34/L98H/S297T/F495I突变株与这个主要进化枝SNP差异较大,可能与TR34/L98H主要克隆株具有不同的进化来源。通过对唑类杀真菌剂使用和植物致病真菌耐药特征进行文献调研分析,以及对烟曲霉与植物致病真菌甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)的氨基酸序列进行比对,发现许多常使用的农业三唑类杀真菌剂与临床三唑类药物具有相似的化学结构,而唑类耐药相关的烟曲霉cyp51A基因Y121、Y431、G432、G448和F495等位点突变,与文献报道的植物病原真菌耐药突变位点存在对应关系。TR34/L98H、TR34/L98H/S297T/F495I和TR46/Y121F/T289A等3种耐药突变烟曲霉均表现出对农业唑类杀菌剂(如氟环唑、糠菌唑、戊唑醇、苯醚甲环唑等)的交叉耐药性,而TR34/L98H/S297T/F495I突变株对抑霉唑和咪鲜胺这2种农业咪唑类杀菌剂的MIC值高于TR34/L98H突变株和唑类敏感株(P<0.01)。对22株烟曲霉的体外耐药诱导实验显示,伊曲康唑可诱导出P216L、G54V等突变的耐药株,而氟环唑、戊唑醇、抑霉唑等也可使敏感烟曲霉转变为泛唑类药物耐药株。本研究提示,TR34/L98H、TR34/L98H/S297T/F495I等环境介导的耐药机制是我国烟曲霉对唑类药物耐药的主要机制,TR46/Y121F/T289A突变型烟曲霉已在我国临床出现,并可能与患者的不良结局有关;我国TR34/L98H/S297T/F495I突变株与国内外其他具有相同或类似突变的耐药株具有不同的基因型,而且遗传背景差异较大,可能具有不同的进化来源;TR34/L98H、TR34/L98H/S297T/F495I等突变株均表现出对农业唑类杀菌剂的交叉耐药性,其中TR34/L98H/S297T/F495I突变株对咪唑类杀菌剂具有更高的耐药性;体外药物筛选压力作用下,农业唑类杀菌剂可诱导出泛唑类药物耐药烟曲霉菌株,提示农业杀菌剂的广泛使用可能是我国烟曲霉耐药性产生的重要原因。与既往研究相比,本研究最主要的创新性在于:(1)国内首次在多地区开展临床和环境烟曲霉唑类耐药性调查研究;(2)国内外首次综合利用多种分子分型技术和全基因组测序技术进行唑类耐药株遗传变异和溯源进化分析研究;(3)创新性地从农业唑类杀菌剂的使用情况、耐药机制比较及其在体外实验条件下导致烟曲霉发生耐药突变的功能验证等多方面,揭示农业唑类杀菌剂使用与烟曲霉耐药性产生之间的关联。本项目的完成对于弥补我国在烟曲霉唑类药物耐药流行规律和耐药产生机制研究领域的不足以及科学防控烟曲霉感染与耐药具有重要意义。