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第一部分miR-409-3p抑制胃癌侵袭转移机制研究背景及目的:胃癌（gastric cancer GC）是我国最常见的恶性肿瘤之一。从我国范围统计,其农村地区的发病率和死亡率明显高于城市地区,且位于我国癌症死亡的第2名。由于胃癌早期症状隐匿,大部分患者确诊时已处于中晚期,且生存率仍然没有明显改善,淋巴、腹膜等远处转移仍是导致患者治疗失败和预后不良的主要原因。研究胃癌侵袭及转移的机制、探索新的治疗靶点对胃癌的治疗或改善胃癌患者的预后是非常有意义的。MicroRNA-409-3p（miR-409-3p）是一种由胚胎干细胞表达的小型非编码多功能miRNA,是miR-409的成熟表达型之一,位于染色体14q32.31,与肿瘤的发生、发展及转移密切相关,其在肿瘤细胞增殖、凋亡、血管形成、迁移及侵袭等各种过程中发挥重要作用而受到了广泛的关注。近年来发现,miR-409-3p在多种恶性肿瘤中表达下调,可通过靶向作用于不同的基因来调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化、侵袭及转移等细胞生物学过程。研究表明miR-409-3p主要通过与靶序列特异性结合,实现对目标基因的降解,并通过在翻译水平上抑制靶基因的表达来发挥作用。GAB1是一种属于Grb2协同的粘合剂（Gab）家族的支架接头分子,在生长因子,细胞因子和抗原受体等信号转导中发挥重要作用。据研究表明GAB1在肿瘤发生、侵袭转移过程中发挥重要作用,尤其是在胃肠道肿瘤。但miR-409-3p是否能通过靶向作用于GAB1来调控胃癌细胞侵袭转移目前尚无此类文献报道。为了探索miR-409-3p抑制胃癌侵袭转移的分子机制,我们试图探讨:1.miR-409-3p在胃癌中的表达情况。2.改变miR-409-3p表达对胃癌细胞侵袭转移的影响。3.筛选-鉴定miR-409-3p在胃癌中的功能靶点。4.干扰靶基因的表达对miR-409-3p在调节胃癌细胞侵袭转移的影响。研究内容与方法:1.实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测BGC823、MNK45、SGC7901、MGC803各组胃癌细胞及正常胃黏膜上皮细胞（GES1）中miR-409-3p的表达情况。在胃癌细胞株中筛选出miR-409-3p表达相对较高及最低的细胞株进行后续实验。2.实时定量PCR（RT-qPCR）法检测30例新鲜胃癌组织及相应的癌旁组织中miR-409-3p的表达水平。3.将合成的miR-409-3p过表达模拟物mimics、miR-409-3p抑制模拟物inhibitor及对应的阴性对照物用脂质体LipofectamineTM2000转染至BGC823、MNK45胃癌细胞株中,并通过RT-qPCR法验证其干扰效果。4.CCK-8实验检测过表达或下调miR-409-3p表达后胃癌细胞的增殖活性。5.Transwell及Matrigel Transwell实验检测过表达或敲低miR-409-3p表达后胃癌细胞的迁移、侵袭能力。6.根据文献报道,我们首先选择常用且较为权威的数据库对miR-409-3p的靶基因进行预测,包括TargetScan、miRanda、miRDB和miRWalk。7.实时定量PCR（RT-qPCR）法检测过表达或下调miR-409-3p表达后胃癌细胞中增殖、侵袭转移相关靶基因在mRNA水平的表达情况。初步筛选出胃癌中miR-409-3p的潜在靶基因。8.双荧光素酶基因报告系统法检测miR-409-3p对GAB1是否具有真正的直接靶向结合作用。9.Western blot法检测过表达或下调miR-409-3p表达后胃癌细胞中GAB1靶基因在蛋白水平的表达情况。10.Transwell及Matrigel Transwell实验检测沉默或过表达GAB1基因表达后胃癌细胞的迁移、侵袭能力。研究结果:1.miR-409-3p在胃癌细胞株中表达较正常胃黏膜上皮细胞明显降低,差异具有统计学意义（P<0.01）。在各株胃癌细胞中筛选出miR-409-3p相对较低表达细胞株BGC823,相对最高表达胃癌细胞株MNK45。2.与对应的癌旁组织相比,miR-409-3p在胃癌组织中的表达明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.过表达或下调miR-409-3p的表达后对胃癌细胞的增殖能力无明显影响。4.过表达miR-409-3p表达后可以抑制胃癌细胞的迁移及侵袭能力,下调miR-409-3p表达后胃癌细胞的迁移及侵袭能力增强;5.通过文献及网站数据库初步预测miR-409-3p在胃癌中增殖、迁移侵袭相关的基因为ZEB1、ELF2、CCND2、AKT1、GAB1。6.过表达miR-409-3p表达后胃癌细胞中GAB1在mRNA水平的表达量明显受到抑制,差异具有统计学意义（P<0.01）;下调miR-409-3p表达后胃癌细胞中GAB1在mRNA水平的表达量明显上调（P<0.01）。7.过表达miR-409-3p表达后胃癌细胞中双荧光素酶的活性明显受到抑制,miR-409-3p能与GAB1基因3’UTR结合,差异显著（P<0.05）;下调miR-409-3p表达后胃癌细胞中荧光素酶的活性增强,抑制了内源miR-409-3p与GAB1基因3’UTR结合（P<0.01）。8.过表达miR-409-3p表达后胃癌细胞中GAB1在蛋白水平的表达量明显受到抑制,差异具有统计学意义（P<0.001）;下调miR-409-3p表达后胃癌细胞中GAB1在蛋白水平的表达量明显上调（P<0.001）。9.过表达miR-409-3p的基础上高表达GAB1基因蛋白表达后增强了胃癌细胞的迁移及侵袭能力;下调miR-409-3p的基础上干扰GAB1基因表达后胃癌细胞的迁移及侵袭能力明显被抑制。结论:MiR-409-3p在胃癌细胞及胃癌组织中的表达明显下调,并且与胃癌细胞迁移及侵袭发生呈负相关;miR-409-3p可通过下调胃癌细胞的迁移和侵袭能力而抑制胃癌转移;miR-409-3p可通过部分靶向下调GAB1表达是抑制胃癌细胞转移的重要途径。第二部分miR-202在慢性粒细胞白血病化疗敏感中作用的研究研究背景及目的:慢性粒细胞白血病（CML）是骨髓造血干细胞克隆性增殖形成的恶性肿瘤,占成人白血病的15-20%,通常影响的人群主要是老年人。中国CML患者较西方更为年轻化,国内几个地区的流行病学调查显示CML中位发病年龄为4550岁,而西方国家CML的中位发病年龄为67岁。CML独特地表达组成型活性酪氨酸激酶BCR/ABL,伊马替尼作为BCR-ABL酪氨酸激酶的特异性抑制剂,因其高效和低毒性而成为治疗CML的首选药物。然而,仍有一部分患者发生原发耐药,出现疾病进展进而进入加速期、急变期,对酪氨酸激酶抑制剂效果差,患者的预后不良。所以,伊马替尼耐药的发展限制了其在CML患者中的长期治疗益处。越来越多的证据表明,血液恶性肿瘤如慢性淋巴细胞白血病（CLL）,B细胞淋巴瘤,急性早幼粒细胞白血病,急性淋巴细胞白血病（ALL）和CML等发病机制中存在特定的miRNA。研究报道miR-202在多种恶性肿瘤中呈低表达,上调miR-202可抑制肿瘤生长,并且可能有助于提高化疗的敏感性。在目前的研究中,我们的目标是初步探讨miR-202在调控CML细胞系伊马替尼敏感性中的潜在作用。研究内容与方法:1.实时荧光定量PCR（RT-q PCR）法检测K562、KU812、EM2、EM3、LAMA84、KCL-22、HL-60各组CML细胞系及从人健康血液样本中分离白细胞中miR-202的表达情况。2.构建K562 CML细胞系的伊马替尼敏感株和耐药株,保存和收集存活细胞克隆用于后续实验。3.将合成的miR-202过表达模拟物mimics及对应的阴性对照物用脂质体Lipofectamine TM2000转染至K562、KU812 CML细胞系中,并通过RT-q PCR法验证其干扰效果。4.MTT、Brd U实验检测过表达miR-202后CML细胞系的增殖活性。5.将K562、KU812细胞用伊马替尼在50,75或100n M处理24小时,然后通过RT-q PCR检测miR-202的表达。6.对K562伊马替尼敏感株和耐药株用伊马替尼在0,0.2,0.4,0.8,1或2μM处理24小时,随后通过MTT测定细胞活力。7.将K562伊马替尼敏感株和耐药株用伊马替尼在0或2μM处理24小时,然后用DAPI染色细胞核。8.将K562伊马替尼敏感株和耐药株用伊马替尼0.4μM处理24小时,然后进行蛋白质印迹分析。9.通过RT-q PCR检测K562伊马替尼敏感株或耐药细胞株中miR-202的表达。研究结果:1.miR-202在7株CML细胞系中表达较正常血液样本中的白细胞明显降低,差异具有统计学意义（P<0.01,P<0.05）。在CML细胞系中筛选出K562、KU812细胞株进行后续实验。2.过表达miR-202后能明显抑制CML细胞系的增殖能力。3.K562、KU812细胞经不同浓度的伊马替尼处理24小时后,miR-202的表达显著抑制（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。4.通过MTT和DAPI法成功筛选伊马替尼耐药性K562细胞系,并成功构建K562伊马替尼敏感株和耐药株。5.K562伊马替尼敏感株和耐药株相比,具有更高百分比的切割PARP;同时检测miR-202的表达发现,对比K562伊马替尼敏感株,K562伊马替尼耐药株中miR-202的表达明显下调（P<0.05）。结论:miR-202在人CML细胞系中的表达明显下调;miR-202的过表达显着抑制CML细胞的增殖速率;伊马替尼处理后的CML细胞系中miR-202的表达明显抑制;伊马替尼耐药的CML细胞系中miR-202表达出更低水平的表达,表明miR-202可能增加伊马替尼对CML靶向治疗的敏感性。