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谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase,TGase)是一种催化酰基发生转移的蛋白酶,主要催化蛋白质或多肽分子中谷氨酰胺残基的γ-酰基发生转移反应,当酰基受体为赖氨酸的ε-氨基时,TGase催化蛋白分子之间或之内形成ε-(γ-谷胺酰)赖氨酸键,使得蛋白发生交联,从而改变其结构和理化性质,甚至带来新的功能,因此,TGase在工农业、食品、化妆品和医药领域中有着极为广泛的应用。 本文利用分子生物学手段将枯草杆菌TGase基因克隆到三种不同的系统中进行了表达,再通过柱层析等蛋白分离纯化技术获得了TGase纯品,并对TGase的性质及作用条件进行了研究。 首先,采用PCR扩增、限制性核酸内切酶酶切、连接以及转化入受体菌等基因工程技术,将枯草杆菌TGase基因分别成功地克隆到枯草杆菌pUB18和pUBD、毕赤酵母pPIC9、大肠杆菌pET32a(+)表达载体中进行表达,结果发现,在这三种不同的表达系统中都产生了表达条带。在枯草杆菌系统中,利用增强子degQ的增强作用,TGase有所表达,但纯化相对较困难;在毕赤酵母系统中,经甲醇诱导后也能产生表达条带,但分子量比预期的大,且检测不到酶活性;而在大肠杆菌系统中,TGase获得了高效的可溶性表达,且发现在TGase的N端融合了硫氧还蛋白(Trx)后仍能保持其生物学活性。 通过上述比较研究,本文选择了使用大肠杆菌系统来表达枯草杆菌TGase基因。在对温度、IPTG浓度等表达条件进行了优化后,电泳扫描结果显示,在上清中表达的Trx-TGase融合蛋白约占菌体可溶性蛋白的5%。取诱导表达的菌液,经超声波破菌后离心,上清液通过金属鳌合层析和SuPerdex75分子筛层析进行分离纯化,获得的样品在电泳中显示为单一条带,证明成功地获得了Trx一TGase融合蛋白纯品。 接着,本文对Trx一TGase融合蛋白及TGase单体的性质进行了比较研究。结果证明,融合蛋白不但具有与TGase单体相同的生物学活性,而且与单体相比还具有更高的稳定性。在此基础上,进一步采用融合蛋白对TGase的作用条件进行了模拟研究。通过对牛血清白蛋白(BSA)的交联,发现随着融合蛋白浓度的增加,被交联的蛋白量逐渐增多,而且约加小时后几乎所有的蛋白都被交联了。此外,还发现融合蛋白对溶菌酶、PEG也具有一定的交联作用。在温度稳定性方面,融合蛋白于4℃保存一周相当稳定,活性几乎无损失,在37℃时,虽然融合蛋白逐渐降解为TGase单体,但其交联蛋白的活性并没有降低。另外,在研究其它物质对大幅度提高TGaseTGase活性的影响时,发现DTI,、筑基乙醇等还原性物质能的生物催化活性,而具有伯胺的物质则能抑制TGase综上所述,本文从枯草杆菌染色体中克隆了枯草杆菌TGase基因,的活性。并在三种不同的系统中获得了表达,其中在大肠杆菌系统中尤其获得了高效可溶性表达,进一步通过亲和层析和分子筛层析得到蛋白纯品后,以BSA为底物对TGase的性质进行了研究,取得较理想的结果,为深入研究枯草杆菌TGase的性质及应用奠定了良好的基础。