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目的:1.设计三个靶向于SMYD3基因的sgRNA。分别记为sgRNA#1、sgRNA#2和sgRNA#3。2.构建sgRNA#1-PX459、sgRNA#2-PX459和sgRNA#3-PX459重组质粒。3.检测SMYD3蛋白在HEK293T细胞和Bel-7402细胞中的表达情况。4.探索Lipofectamine?2000:1μg的sgRNA-PX459重组质粒最佳的包裹比例。5.比较不同浓度嘌呤霉素分别作用于HEK293T细胞和Bel-7402细胞,确定三天时最低致死浓度。6.比较CRISPR/Cas9打靶载体的活性。7.制备SMYD3基因缺陷型Bel-7402细胞株。8.比较SMYD3基因缺陷型Bel-7402细胞株与野生型Bel-7402细胞的增殖能力。9.比较SMYD3基因缺陷型Bel-7402细胞株与野生型Bel-7402细胞的迁移能力。方法:1.在GenBank网站,搜索人SMYD3基因序列。在http://crispr.mit.edu/网站,设计靶向于SMYD3基因的sgRNA。2.使PX459质粒线性化,把sgRNA连接入线性化的PX459,构建sgRNA-PX459重组质粒。3.用不同体积的Lipofectamine?2000分别对1μg sgRNA#1-PX459、sgRNA#2-PX459和sgRNA#3-PX459重组质粒进行包裹,琼脂糖凝胶电泳分析最佳的包裹比例。4.用不同浓度的嘌呤霉素分别作用于HEK293T细胞和Bel-7402细胞,连续作用三天,显微镜观察,确定作用三天时最低致死浓度。5.分别用sgRNA#1-PX459、sgRNA#2-PX459和sgRNA#3-PX459重组质粒转染HEK293T细胞,PCR产物测序,确定CRISPR/Cas9打靶载体的活性。6.通过极限稀释法获得Bel-7402单克隆细胞株。7.通过Western Blot检测单克隆细胞株的SMYD3蛋白的表达情况。8.对无SMYD3蛋白表达的Bel-7402单克隆细胞株进行PCR产物连接TA载体测序,确定SMYD3基因缺陷型Bel-7402单克隆细胞株。9.通过CCK-8实验比较SMYD3基因缺陷型Bel-7402细胞株与野生型Bel-7402细胞的增殖能力。10.通过划痕实验比较SMYD3基因缺陷型Bel-7402细胞株与野生型Bel-7402细胞的迁移能力。结果:1.设计了三个靶向于SMYD3基因的sgRNA,其基因序列如下:2.使用不同体积的Lipofectamine?2000进行包裹DNA实验,确定sgRNA#1-PX459:Lipofectamine?2000最佳包裹比例为1μg:3μl,sgRNA#2-PX459:Lipofectamine?2000最佳包裹比例为1μg:3μl,sgRNA#3-PX459:Lipofectamine?2000最佳包裹比例为1μg:3μl。3.不同浓度嘌呤霉素分别作用于HEK293T细胞和Bel-7402细胞,作用三天时HEK293T细胞最低致死浓度为2μg/ml,Bel-7402细胞最低致死浓度为17μg/ml。4.PCR产物测序,确定CRISPR/Cas9打靶载体的活性。结果表明:sgRNA#1-PX459有活性,sg RNA#2-PX459和sgRNA#3-PX459没有活性。5.应用极限稀释法,共获得42株Bel-7402单克隆细胞株。6.Western Blot检测表明,编码#23号单克隆细胞株没有SMYD3蛋白表达。7.测序结果表明:编码#23号单克隆细胞株只有一种测序类型,获得SMYD3基因缺陷型Bel-7402单克隆细胞株。8.划痕实验表明SMYD3基因缺陷型Bel-7402细胞比野生型Bel-7402细胞的迁移能力弱。9.CCK-8实验表明SMYD3基因缺陷型Bel-7402细胞比野生型Bel-7402细胞的增殖能力弱。结论:1.成功构建一种靶向于SMYD3基因的打靶载体sgRNA#1-PX459重组质粒。2.Western Blot和TA克隆测序结果表明编号#23号单克隆细胞株为SMYD3基因缺陷型Bel-7402细胞株。3.SMYD3基因缺陷型Bel-7402细胞和野生型Bel-7402细胞相比,增殖,迁移能力减弱。