研究背景：结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,由于早期发现和治疗方法的进步,结直肠癌的死亡率在过去三十年有一定程度下降,但随着人们生活水平的提高以及生活方式的改变,近年来我国的结直肠癌发病率却有所上升。侵袭转移是结直肠癌治疗失败导致患者死亡的最主要原因。因此,探讨与结直肠癌侵袭转移密切相关的因素势在必行。恶性肿瘤的发生和发展是一个多因素、多步骤的复杂生物学行为过程。对恶性肿瘤发生、发展、浸润及转移机制和寻求新的特效治疗方法与手段一直是研究热点。近年来微小FRNA (microRNA, miRNA)逐渐被研究者重视,成为肿瘤研究的热点。miRNA是真核生物细胞中一类长度约为18-24核营酸的内源性非编码小分子RNA。它由DNA转录产生,但并不翻译蛋白质,而是在蛋白质合成中起调节其他基因的功能,是调控其他蛋白质编码基因的基因。rniRNA通过与靶基因mRNA的3’-非编码区(3’-untranslated region,3’-UTR)以完全或不完全互补配对的方式结合,降解或者抑制靶基因rnRNA。miRNA与基因之间的作用是错综复杂的,一个miRNA可调控多个基因的rmRNAs,一个基因的mRNAs也可由多个miRNAs调控,此外,基因也可参与对miRNAs的调控。miR-200家族是近年来研究的热点,miR-200a作为miR-200家族(包括miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-114, miR-429)的一员在多种肿瘤中表达下调,主要通过调控上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)过程,对肿瘤的侵袭转移起到关键作用。肿瘤细胞EMT的发生包括诸多因素,主要有转录因子表达上调以及各种信号通路激活。大量研究表明AKT和ERK信号通路的激活在结直肠癌EMT的发生中起到重要作用,另外有报道称在人肝癌细胞系和人胰腺癌细胞系中miR-200a能通过其靶基因调控AKT信号通路活性,但在人结直肠癌中miR-200a、EMT和AKT/ERK信号通路三者间的关系尚未见相关报道。在大多数肿瘤的发生和发展过程中,miR-200a充当抑癌基因的功能。miR-200a在结直肠癌的表达情况各报道不尽一致,有研究显示miR-200a在结直肠癌中表达下调,但也有研究称miR-200a在结直肠癌的表达是上调的,对于miR-200a在结直肠癌中的生物学作用及机制少见报道。本研究组前期研究显示miR-200a在结直肠癌组织和细胞中表达是下调的,并且miR-200a与结直肠癌组织分化和侵袭转移潜能相关,在此基础上,本研究通过在三种人结直肠癌细胞系中上调或下调miR-200a的表达观察其对结直肠癌细胞生物学行为的影响,并检测EMT相关标志物及AKT／ERK信号通路相关蛋白变化,探讨结直肠癌中miR-200a与EMT的关系及相关调节机制。EMT最初在胚胎发育过程中如原肠胚形成、肾器官发育及神经嵴形成中被描述。随着EMT在肿瘤侵袭转移中的作用被广泛研究,普遍认为发生EMT的肿瘤侵袭和转移能力更强,能够发生侵袭转移的癌细胞EMT特征往往较明显。然而,从非侵袭性肿瘤到侵袭性肿瘤是否真正存在EMT仍然存在争议。一个最主要的质疑观点就是原发性肿瘤与其转移性肿瘤具有组织病理学相似性。有研究称EMT细胞和非EMT细胞共同协作完成远处转移过程,EMT细胞负责降解细胞周围基质,为非EMT细胞的侵袭、转移开路,最终能在远处部位定植的是非EMT细胞而不是EMT细胞。甚至有学者质疑肿瘤发生EMT的真实性。为了解释这些疑点,在转移部位的间质-上皮转化(mesenchymal-epithelial transition,MET)作为一个假设在转移性肿瘤形成过程中被提了出来。根据这个假设,发生EMT的细胞改变其黏附性及激活蛋白质分解而具备移动性,允许它们离开原发肿瘤,在远处部位建立继发肿瘤。在远处部位定植过程中,一个逆转的过程-MET发生了,转移性肿瘤重新获得了上皮表型。MET的假设可以很好地解释原发性肿瘤与其转移性肿瘤为何具有组织病理学相似性。但是,对肿瘤转移过程MET的发生至今仍然缺乏直接实验证据。本研究通过探讨结直肠癌与其淋巴结转移癌组织及结直肠癌细胞系SW480、SW620的EMT特征差异,期望进-步了解EMT在结直肠癌转移中的作用。并且通过对比多种上皮性肿瘤的原发癌、转移癌与其癌栓的组织形态学特点及E-cadherin和Vimentin表达情况,从组织学水平探讨肿瘤细胞在转移过程中是否遵循EMT-MET机制。为了深入了解结直肠癌发病的分子机制和寻找新的治疗靶点,本课题着重进行了如下研究,来探讨miR-200a和EMT在结直肠癌中的作用。目的：1.探讨通过上调和下调miR-200a的表达对人结直肠癌细胞生物学行为的影响。2.通过观察在人结直肠癌细胞中下调和上调miR-200a表达对EMT相关标志物及AKT/ERK信号通路相关蛋白表达的影响,探讨结直肠癌细胞中miR-200a与EMT的关系及相关调节机制。3.通过对比多种上皮性肿瘤的原发癌、淋巴结转移癌与其癌栓的组织形态学特点及E-cadherin和Vimentin表达情况,从组织学水平探讨EMT在肿瘤细胞转移过程中的作用。4.探讨结直肠癌与其淋巴结转移癌组织及结直肠癌细胞系SW480、SW620的EMT特征差异,进一步了解EMT在结直肠癌转移中的作用。方法：1.将inhibitor/miR-200a和mimics/miR-200a分别瞬时转染入结直肠癌细胞系HCT116、SW480和LoVo、SW480来下调和上调1niR-200a的表达,通过实时荧光定量PCR检测下调和上调效果,然后通过CCK-8、TUNEL法、Transwell迁移实验及同质性细胞黏附实验检测细胞的增殖、凋亡、迁移和黏附能力；实时荧光定量PCR和细胞蜡块免疫化学方法检测E-cadherin和Vimentin在mRNA和蛋白水平的表达变化；Western Blot检测细胞中相关基因(PTEN、p-AKT、p-ERK1/2、AKT、ERK2、CD147、MMP-9)在蛋白水平的表达变化。2.生物信息学方法预测niR-200a与PTEN结合情况。3.59例经病理诊断证实的原发性腺癌或原发性鳞状细胞癌及其淋巴结转移癌患者的68个石蜡组织标本,其中高分化癌组织13例,中分化癌11例,低分化癌30例,淋巴结转移癌14例,每例均有血管内或淋巴管内癌栓。挑选同一切面上同时具有癌组织(包含原发癌或淋巴结转移癌)及癌栓的蜡块进行HE染色观察形态及免疫组织化学检测E-cadherin和Vimentin表达。4.实时荧光定量PCR检测结直肠癌细胞系SW480和SW620E-cadherin和Vimentin的mRNA表达；免疫组化检测30例配对结直肠癌及其转移淋巴结的石蜡组织标本中E-cadherin和Vimentin的表达,HE染色观察30例配对结直肠癌及其淋巴结转移癌组织形态以及SW480和SW620的细胞形态。结果：1.下调miR-200a的表达对HCT116和SW480的影响下调HCT116和SW480中miR-200a的表达后,实时荧光定量PCR检测48h抑制效率分别约为50.9%和54.4%。CCK-8法显示,HCT116和SW480各自三组间细胞增殖能力存在显著性差异(分别F=4.009,P=0.031；F=6.122,P=0.004),两种细胞的miR-200a/inhibitor组的增殖能力均比blank组和negative control组显著增加(P=0.038,P=0.034和P=0.004,P=0.003)；Transwell迁移实验显示,HCT116和SW480各自三组间细胞的穿膜数量存在显著性差异(分别F=102.452,P=0.000；F=41.632,P=0.000),两种细胞的miR-200a/inhibitor组的穿膜数量均比blank组和negative control组显著增多(全部P=0.000)；TUNEL法检测显示,HCT116和SW480的各自三组间凋亡指数存在显著性差异(分别F=19.932,P=0.000；F=34.720,P=0.000),两种细胞的miR-200a/inhibitor组的凋亡指数均比blank组和negative control组显著减少(分别P=0.003,P=0.003和P=0.001,P=0.000)；同质性细胞黏附实验显示,HCT116和SW480的同质性黏附能力较negative control组显著减弱(分别t=8.060,P=0.000；t=3.668,P=0.004)；实时荧光定量PCR检测结果显示,miR-200a表达下调后,在mRNA水平E-cadherin表达显著下降(分别t=-27.163,P=0.001；t=-5.079,P=0.037)、Vimentin的表达显著升高(分别t=75.054,P=0.000；t=14.068,P=0.005)；细胞免疫化学结果显示,下调miR-200a的表达后,HCT116和SW480E-cadherin的表达减弱、Vimentin的表达增强。Western Blot显示下调miR-200a后,HCT116和SW480PTEN的表达减弱,p-AKT、p-ERK1/2,CD147和MMP-9的表达增强,而AKT, ERK2表达无变化。2.上调miR-200a的表达对LoVoISW480的影响上调LoVo和SW480中miR-200a的表达后,实时荧光定量PCR检测48hmiR-200a/mimics组表达倍数为negative control组2053倍和102倍。CCK-8法显示LoVo和SW480各自三组间细胞增殖能力存在显著性差异(分别F=101.928,P=0.000；F=27.583,P=0.000),两种细胞的miR-200a/mimics组的增殖能力均比blank组和negative control组显著减弱(全部P=0.000)；Transwell迁移实验显示,LoVo和SW480各自三组间细胞的穿膜数量存在显著性差异(分别F=119.464,P=0.000；F=58.670,P=0.000),两种细胞的1niR-200a/mimics组的穿膜数量均比blank组和negative control组显著减少(全部P=0.000)；TUNEL法检测显示,LoVo和SW480的各自三组间凋亡指数存在显著性差异(分别F=25.620,P=0.000；F=25.159,P=0.000),两种细胞的miR-200a/mimics组的凋亡指数均比blank组和negative control组显著增多(全部P=0.000)；同质性细胞黏附实验显示上调miR-200a的表达后,LoVo和SW480的同质性黏附能力较negative control组显著增强(分别t=-4.250,P=0.005；t=-4.190,P=0.006)；实时荧光定量PCR检测显示,miR-200a表达上调后,LoVo和SW480在mRNA水平的E-cadherin表达显著增加(分别t=15.006,P=0.004；t=23.844,P=0.002)、Vimentin表达显著减少(分别t=-6.010,P=0.027；t=-9.081,P=0.012)；细胞免疫化学显示上调rniR-200a表达后,LoVo和SW480E-cadherin的表达增强、Vimentin的表达减弱。Western Blot显示上调miR-200a后,LoVo和SW480PTEN的表达增强,p-AKT、p-ERK1/2、CD147和MMP-9的表达减弱,而AKT,ERK2表达无变化。3.生物信息学软件预测显示PTEN是miR-200a的潜在靶基因。4.癌组织与癌栓具有相似形态特征；54例原发性癌组织E-cadherin和Vimentin阳性分别为50例和23例,其癌栓阳性分别为51例和22例,经统计两者的E-cadherin和Vimentin表达差异无统计学意义(分别Z=-0.248,P=0.804；Z=-0.199,P=0.842)；14例淋巴结转移性癌组织E-cadherin和Vimentin阳性分别为12例和6例,其癌栓E-cadherin和Vimentin阳性分别为12例和7例,两者的E-cadherin和Vimentin表达差异无统计学意义(分别Z=-1.727,P=0.084；Z=-0.154,P=0.878)；癌组织(包含原发癌或淋巴结转移癌)及其癌栓的E-cadherin和Vimentin的表达差异均无统计学意义(分别Z=-0.824,P=0.410；Z=-0.222,P=0.824)；癌栓部分癌细胞高表达E-cadherin而Vimentin缺失,部分癌细胞高表达Vimentin而E-cadherin缺失。5.SW480与SW620中E-cadherin和Vimentin的mRNA表达差异具有统计学意义(分别t=10.837,P=0.008；t=4.796,P=0.041),均以后者为高；E-cadherin和Vimentin在结直肠癌与其淋巴结转移癌组织中的表达差异无统计学意义(分别Z=-0.235,P=0.814；Z=-0.479,P=0.632)。部分淋巴结转移癌中E-cadherin的表达高于结直肠癌(4／30),且Vimentin表达比结直肠癌弱,甚至表达缺失(6／30)；结直肠癌与其淋巴结转移癌组织具有相似的形态学特征；SW480和SW620两者形态类似。结论：1.miR-200a在人结直肠癌中起抑癌基因作用,miR-200a表达的下调能减弱结直肠癌细胞间黏附能力,增加细胞迁移、增殖能力而阻遏凋亡,从而影响结直肠癌的进展。2.miR-200a能调控结直肠癌细胞EMT,并通过调节、控制AKT/ERK通路活性及其上下游众多重要基因而最终影响结直肠癌EMT,从而在结直肠癌中起到多功能的生物学调控作用包括细胞增殖、凋亡、黏附、迁移和侵袭转移。3.原发癌及其淋巴结转移癌、癌栓三者EMT特征无显著差异；癌栓细胞既有EMT细胞也有非EMT细胞,推测发生EMT的肿瘤细胞改变它们的黏附性及激活蛋白质分解而具备移动性,允许它们离开原发肿瘤进入脉管；进入脉管的部分EMT细胞发生了MET从而癌栓细胞既有EMT细胞也有非EMT细胞,而未发生MET的EMT细胞为远处部位建立转移癌灶提供了可能；在转移癌灶中部分癌细胞发生MET,重新获得上皮表型,部分癌细胞仍保留EMT特征,所以原发癌及其淋巴结转移癌的EMT特征无显著差异,而部分癌细胞保留EMT特征可能是更远部位发生转移的原因。4.结直肠癌与其淋巴结转移癌组织和细胞的EMT特征无显著差异,推测机制与结论3相同,但这需要进一步实验研究证明。