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目的:原发性肝癌诱发的死亡率在全球范围内居高不下,已经上升至第3位。我国是肝癌的高发病区,每年的新发的肝癌患者约有50%集中在我国,肝癌死亡率排在第二位[1-3]。肝癌的发生和发展是一个多因素,多步骤的复杂过程。探究基因表达变化与肝癌发生发展以及恶性特征之间的关系,寻求有效的诊断标志物和治疗靶点仍然是肝癌研究的重要关注点。CIP2A是PP2A重要的内源性抑制因子,被认为是生物体重要的肿瘤蛋白。CIP2A能够直接与致癌性转录因子MYC相互作用,通过MYC第62位丝氨酸抑制PP2A活性,并最终稳定细胞中MYC的表达量,防止其降解。已经有许多研究显示在许多类型的恶性肿瘤中CIP2A异常高表达,包括前列腺癌,乳腺癌,肺癌,胃癌以及头颈部鳞癌[4-7]。在本次研究中我们将分析CIP2A在肝癌中的表达模式及其发挥的生物学作用。MicroRNAs（miRNAs）是一类由内源基因编码的,长度约为20-25个核苷酸的非编码单链小RNA,其主要功能为通过与mRNA3’UTR特异性结合,诱导mRNA降解或抑制mRNA翻译[8]。miRNA参与调控细胞早期发育,细胞分化,细胞增殖、凋亡及代谢等多种生理过程[9]。近来更有大量研究证实miRNA的异常表达与包括肝癌在内的多种肿瘤的发生和发展密切相关。miRNA可以调控肿瘤细胞分化,增殖,凋亡,迁移和侵袭等过程[10]。在本次研究中我们将通过软件预测CIP2A上游可能的miRNA,并分析其在肝癌组织中的表达水平。明确miRNA通过CIP2A调控肝癌细胞生物学行为的分子网络,为临床诊断和治疗肝癌提供新思路。研究方法:1、组织样本80例肝癌组织样本及10例正常肝脏组织取自于2015年9月-2017年9月期间在中国医科大学附属第四医院进行肝癌切除手术的患者。2、免疫组织化学组织样本取得后用石蜡进行包埋并制备切片。样本切片进行脱蜡,水化,抗原修复,非特异性封闭以及抗体孵育。本实验所用一抗为CIP2A,4℃孵育过夜。切片滴加生物素标记的二抗工作液,37℃孵育30分钟。抗体孵育过后,使用DAB染色试剂盒进行染色,苏木素染色液进行复染。两位病理专家对所有样本进行双盲检测。3、细胞培养人正常肝细胞HL7702（L-02）,肝癌细胞系BEL-7402以及HUH7购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,肝癌细胞系SK-HEP-1购于美国典型培养物保藏中心（ATCC）。培养基为含10%胎牛血清的DMEM及RPMI-1640培养基。培养条件为37℃,5%CO2以及饱和湿度。4.细胞转染与干扰CIP2A质粒及空载质粒购于美国Origene公司,CIP2A siRNA及non-targeting siRNA购于美国Dharmacon公司。miR-548b-3p mimic,miR-548b-3p inhibitor及对照购于广州锐博生物技术有限公司。转染试剂Lipofectamine 2000及DharmaFECT购于美国赛默飞世尔公司,并按照产品说明的剂量和方法进行使用。5、western blot提取样本总蛋白使用RIPA细胞裂解液。本实验所用的抗体为一抗CIP2A,c-myc,bcl-2,cleaved-PARP,actin以及辣根过氧化物酶耦合的二抗。采用ECL发光法。6、实时荧光定量PCR提取样本总RNA使用Trizol试剂。反转录使用PrimeScrip RT Master Mix以及PrimeScrip RT Reagent Kit试剂盒。实时荧光定量PCR使用SYBR Green master mix试剂盒。PCR使用仪器为7500 Real-Time PCR System。基因的扩增倍数根据2-ΔΔCt计算。内参选用actin以及u6。7、细胞增殖实验MTT:单细胞悬液接种于96孔板中,恒温孵育依次24,48,72,96小时。孔板中分别加入MTT溶液,并继续培养4小时。去除培养基,加入DMSO。调整酶标仪波长并进行检测。集落形成实验:单细胞悬液接种于细胞培养皿中,连续培养14天。吉姆萨染色液对细胞进行染色。显微镜下进行计数,细胞数目超过50个即可记为一个细胞集落。8、流式细胞术细胞周期:收集并温和漂洗细胞。细胞混合液中加入预冷的75%酒精固定细胞。移除乙醇溶液并温和漂洗细胞。重悬细胞后加入PI染料,避光孵育,并用流式细胞仪检测细胞周期变化。细胞凋亡:收集并温和漂洗细胞。细胞混合液中加入AnnexinV-FITC以及PI染色试剂,避光孵育,并用流式细胞仪检测细胞凋亡水平变化。线粒体膜电位:收集并温和漂洗细胞。细胞混合液中加入JC-1荧光染料,恒温孵育45分钟。PBS缓冲液温和漂洗并重悬细胞。采用流式细胞仪分析细胞中线粒体膜电位的变化。9、荧光素酶报告基因实验构建荧光素酶报告基因质粒,并与miR-548b-3p mimic共转染于肝癌细胞中,检测荧光强度分析CIP2A是否为miR-548b-3p的直接作用靶基因。10、统计分析统计分析使用SPSS 16.0软件。CIP2A的表达与患者临床病理因素之间的关系用卡方检验;生存分析采用Kaplan-Meier法,用Log-rank检验判断差异性。处理组与对照组实验结果采用Student′s t检验法。所得数据用均值±标准差表示。p<0.05表示存在统计学意义。结果:1、CIP2A在肝癌组织中高表达。CIP2A在肝癌组织中表达上调,上调比例为40%（32/80）。CIP2A高水平表达的患者其生存年限较短。2、CIP2A促进肝癌细胞增殖。CIP2A过表达后,肝癌细胞的增殖率升高,形成的细胞集落数目增加。CIP2A表达下调后,肝癌细胞的增殖率降低,形成的细胞集落数目减少。3、CIP2A调控肝癌细胞中c-myc,bcl-2以及cleaved-PARP的表达。CIP2A过表达上调肝癌细胞中c-myc,bcl-2,下调cleaved-PARP的表达水平。干扰CIP2A下调肝癌细胞中c-myc,bcl-2,上调cleaved-PARP的表达水平。4、miR-548b-3p在肝癌组织中表达下调。实时荧光定量PCR结果显示20对肝癌组织及健康肝脏组织中的12对呈现miR-548b-3p在肝癌组织中表达下调的现象。生物信息学分析miR-548b-3p在肝癌组织中较健康肝脏组织表达水平下调。5、miR-548b-3p抑制肝癌细胞增殖。转染miR-548b-3p mimic后,肝癌细胞的增殖率降低,形成的细胞集落数目减少。转染miR-548b-3p inhibitor后,肝癌细胞的增殖率升高,形成的细胞集落数目增加。6、miR-548b-3p抑制肝癌细胞周期转化。转染miR-548b-3p mimic抑制肝癌细胞周期转化;转染miR-548b-3p inhibitor后促进细胞周期转化。7、miR-548b-3p增强肝癌细胞的化疗敏感性。转染miR-548b-3p mimic后,CDDP诱导的细胞凋亡水平增加;转染miR-548b-3p inhibitor后,CDDP诱导的细胞凋亡水平减少。8、miR-548b-3p调控肝癌细胞的线粒体膜电位。转染miR-548b-3p mimic后,肝癌细胞线粒体膜电位降低;转染miR-548b-3p inhibitor后,肝癌细胞线粒体膜电位升高。9、miR-548b-3p调控肝癌细胞中c-myc,bcl-2以及cleaved-PARP的表达。肝癌细胞中miR-548b-3p过表达下调CIP2A,c-myc,bcl-2的表达量,上调cleaved-PARP的表达量。miR548b-3p表达缺失上调CIP2A,c-myc,bcl-2的表达量,下调cleaved-PARP的表达量。10、CIP2A为肝癌细胞中miR-548b-3p的直接作用靶基因。肝癌细胞中共转染野生型CIP2A基因（结合位点为CUGAUCU）及miR-548b-3p mimic后,荧光强度降低;共转染突变型CIP2A（结合位点为CGGGCGU）基因及miR-548b-3p mimic后,荧光强度基本不变。11、miR-548b-3p通过CIP2A调控肝癌细胞的增殖。转染miR-548b-3p mimic后肝癌细胞的活性降低,转染miR-548b-3p mimic的同时干扰CIP2A后,细胞的活性进一步降低。转染miR-548b-3p inhibitor后肝癌细胞的活性增强,转染miR-548b-3p inhibitor的同时干扰CIP2A基因后,细胞活性降低。表明miR-548b-3p通过其靶基因CIP2A抑制肝癌细胞的增殖。结论:肝癌组织中CIP2A表达量上调,miR-548b-3p表达量下调。miR-548b-3p以CIP2A为直接作用靶基因,调控肝癌细胞的增殖,周期转化,化疗抗性等生物学行为。