现代化农业发展导致除草剂过量使用,由此造成的环境污染问题日益引起全社会的高度关注,解决农药残留的方法不断被提出和更新。微生物作为自然界中广泛的分解者,利用其解决除草剂污染问题已成为近年来的研究热点。芳氧苯氧丙酸类和氯乙酰胺类除草剂是我国除草甘膦外,使用量最大的两类除草剂,而精噁唑禾草灵和乙草胺又是这两类除草剂中生产量和销售量最大的品种。本论文以精噁唑禾草灵(FE)为主要研究目标,阐述其微生物降解的部分机制,并进一步完善乙草胺的微生物降解机制,揭示参与2,6-甲乙基苯胺(MEA)降解的相关基因和降解酶,以期为这两类除草剂污染的生物修复及抗除草剂转基因作物的研究提供理论基础和微生物资源。本研究从长期受除草剂污染的土壤中富集一组高效降解FE的微生物菌群W1。利用HPLC-MS鉴定了FE降解的主要中间产物为精噁唑禾草灵酸(FA)、6-氯苯并噁唑酮(CDHB)、对羟基苯氧丙酸(HPP)和2-氨基-5-氯苯酚(2A5CP),因此推测了FE微生物降解的上游途径。细菌多样性分析表明:尽管菌群W1长期利用FE作为唯一碳源培养,但仍具有丰富的细菌多样性,且多数为不可培养微生物。从菌群W1中分离到一株可以将FE转化为FA的菌株Acinetobacter sp.DL-2,即该菌株降解FE是通过断裂其酯键实现的。利用鸟枪法建库筛选到精噁唑禾草灵酯酶基因afeH,其编码的FE水解酯酶AfeH具有α/β水解酶家族蛋白典型的三联体催化活性位点Ser-Glu/Asp-His(Ser159,Asp253,His283),以及该家族蛋白的特征序列标签(G-X-S-X-G),并将AfeH鉴定为酯酶第Ⅶ家族的一个新成员。将FE水解酯酶基因afeH在E.coli BL21(DE3)中重组表达,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后获得纯酶,并表征了重组酯酶rAfeH的酶学特性。rAfeH具有广泛的水解底物谱,除对常见的芳氧苯氧丙酸类除草剂具有水解活性;同时对对硝基苯酯类和羧酸甘油酯类化合物具有水解活性,且随着碳链的延长水解活性逐渐减弱。从菌群W1中分离一株CDHB降解菌株Pigmentiphaga sp.DL-8,并对该属菌株首次进行基因组测序。菌株DL-8降解CDHB的中间产物为2A5CP,并鉴定了2A5CP自发缩合形成的产物9-氯-2-氨基-酚嗪-3-酮(CAPO),推测了菌株DL-8降解CDHB的完整代谢途径。通过硫酸按沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Butyl-650M疏水层析等蛋白质纯化手段,从菌株DL-8中将CDHB水解酶CbaA纯化20倍,回收率达到4%,并对CbaA纯酶的酶学特性进行表征。根据CbaA肽指纹图谱结果,将CbaA的编码基因定位在菌株DL-8基因组Scaffold112上的orf5246。Orf5246编码的氨基酸序列具有环化酶和芳基甲酰胺水解酶两个结构域,其氨基酸序列与PDB蛋白质数据库中靛红水解酶(4 JON)具有最高相似性25%,且在作用底物结构和酶功能上极其相似。CbaA含有该类水解酶的三个活性中心His137、His288和Glu301;但是CbaA没有该类酶保守的HXGTHXDXPXH的金属结合区域。因此,将CbaA鉴定为该水解酶家族的一个新成员。构建表达菌株E.coli BL21(DE3-pET-cbaA),利用HPLC检测重组菌株静息细胞转化CDHB的产物为2A5CP,利用GC-MS鉴定了BOA的转化产物为邻氨基苯酚(2AP)。利用同源重组的方法对菌株DL-8中的cbaA基因进行沉默,突变菌株丧失了降解CDHB的能力。通过对菌株DL-8基因组进行挖掘,发现CDHB下游代谢2A5CP基因簇并对关键基因的功能进行验证,进一步完善了CDHB的微生物代谢机制。MEA是乙草胺等氯乙酰胺类除草剂光解、水解和生物降解的重要中间产物。本研究通过连续传代培养的方法获得MEA降解菌株Sphingobium sp.MEA3-1的突变菌株MEA3-1Mut,突变型菌株仅能将MEA转化至MEHQ,丟失完全矿化MEA的能力。野生型菌株可以矿化多种烷基取代苯胺或苯酚类化合物,同时也可以矿化4-羟基-2,6-二甲基苯胺(4-OH-DMA);而突变型菌株仅可以转化该类化合物,不能降解4-OH-DMA。由于菌株MEA3-1不能代谢苯胺,因此推测其代谢MEA的过程不同于苯胺类化合物代谢机制。利用HPLC-MS分别鉴定了野生型和突变型菌株代谢MEA的中间产物,结合菌株的降解底物谱,首次推测了MEA的微生物降解的上游途径。MEA的代谢起始反应是在对位羟基化形成4-OH-MEA;4-OH-MEA自然氧化形成对苯醌亚胺类物质2,6-甲乙基对苯醌亚胺(MEBQI);MEBQI在水溶液中可以自发水解脱氨形成MEHQ;MEHQ在苯环3号位被羟基化形成3-羟基-2,6-甲乙基对苯二酚(3-OH-MEHQ);3-OH-MEHQ在开环酶的作用下打开苯环,从而被完全降解。利用454-二代测序技术对菌株MEA3-1进行全基因组框架图测序,结合生物信息学分析和PCR验证等手段,成功拼接了该菌株中7个完整的环状质粒序列,最大的质粒长度达300 kb,最小的仅6 kb。比对野生型和突变型的质粒组图谱发现,野生型菌株的大质粒pMEA02丢失部分片段,因此推测MEA降解过程中的某个关键基因(簇)位于该大质粒上。利用2-D电泳技术比较野生型和突变型菌株的蛋白质组,结果发现3个明显的蛋白差异点。将3个蛋白差异点的肽指纹图谱数据与菌株MEA3-1的基因组进行匹配,恰好定位在大质粒pMEA02的contig10和20上,通过生物信息学分析在contig20上发现假定的MEHQ单加氧酶基因meaA。MeaA与双组份黄素单加氧酶氧化酶组分C2-hpah具有25%的相似性,且含有该类单加氧酶保守的Trp86、His94和His367氨基酸残基,推测MeaA可能是黄素单加氧酶家族的一个新成员。在meaA基因上游找到可能的还原酶基因meaB,与C1-hpah仅有不到10%的相似性,但与细胞色素c有40%相似性和30%的覆盖度。启动子分析显示meaA与meaB共用一个启动子,反转录PCR结果表明2个基因是组成型表达。将meaBA导入菌株MEA3-1Mut中,突变型菌株重新获得完全矿化MEA的能力;将meaBA导入Psedomonas putida KT2440中亦可以检测到4-OH-MEA被转化,但meaBA无论用自身启动子还是T7启动子,在E.coli中均检测不到降解能力。细胞色素P450专一性抑制剂甲吡酮对菌株降解MEA影响较大,因此推测MEA代谢转化为4-OH-MEA的反应是由细胞色素P450酶系完成的。另外,利用奈氏试剂比色法模拟MEBQI在水溶液中自发水解脱氨转化为MEHQ的过程。