采用基因表达谱芯片技术、实时荧光定量PCR、叶绿素荧光技术、基因克隆、原核表达等分子生物学和生物化学方法,研究了水稻叶内ABA-紫黄质循环和氧化还原平衡及其介导下的活性氧清除系统对高盐/低温逆境的响应。第一,水稻响应高盐/低温胁迫的ABA-紫黄质循环和氧化还原网络的构建。氧化还原网络具有清除ROS的功能,由抗氧化的非酶类物质如抗坏血酸(ASC)、谷胱甘肽、生育酚等和抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)等组成。基因表达谱芯片的数据分析表明,该系统涉及191个基因和/或EST。在低温逆境下,籼稻(i-93-11)/粳稻(j-NJ-1)表达上调(2倍以上,下同)基因有5/5个、下调(0.5倍以下,下同)基因有2/6个；在高盐胁迫下,表达上调基因32/27个、下调基因13/25个。ABA-紫黄质循环体系包括ABA合成、ABA分解途径和紫黄质循环。基因表达谱芯片的数据分析表明,该系统涉及22个基因和/或EST。在低温逆境下,籼/粳稻表达上调基因3/2个,没有检测到表达下调基因；在高盐胁迫下,籼/粳稻表达上调基因7/6个、下调基因6/5个。在高盐/低温胁迫下,NCED基因、8’OX基因、ZEP和VDE基因表达量发生了显著变化,这些基因的产物分别是ABA合成、ABA分解途径和紫黄质循环中的关键酶,说明ABA-紫黄质循环在逆境条件下也起着关键作用。进一步根据水稻基因表达谱芯片数据构建了水稻响应高盐/低温胁迫的ABA-紫黄质循环和氧化还原平衡介导的ROS清除网络,这是一个庞杂的酶促和非酶促生化反应网络体系,涉及到光合电子传递、呼吸链电子传递。该体系在细胞质、叶绿体(基质、类囊体膜、类囊体腔)和线粒体(内膜和基质)、过氧化物体等中进行。水稻中至少包括191个和22个基因组成的网络分别参与ROS的调控和ABA-紫黄质循环,该网络具有高度的灵活性和互补性。抗坏血酸(ASC)的氧化还原作用将ROS清除系统和ABA-紫黄质循环有机地联系在起,形成一个复杂的网络系统,在保护水稻光合机构免受氧化伤害的过程中起着非常重要的作用。第二,高盐或低温胁迫下ABA-紫黄质循环体系的保护作用。ABA预处理(+ABA)和非ABA预处理(-ABA)水稻叶片分别进行高盐胁迫(+SS)和非高盐胁迫(-SS)、低温处理(+LT)和非低温处理(-LT)后,置入1500μmolm-2s-1的PFD下,测定不同处理水稻叶片的PS Ⅱ实际光化学效率(φPS Ⅱ)、非光化学淬灭(NPQ)、紫黄质循环组分,并对紫黄质(V)的脱环氧化作用进行了动力学分析。采用RTqPCR技术,研究了ABA代谢和紫黄质循环相关基因在不同处理条件下的表达情况。根据水稻基因组序列和已知的ABA代谢和紫黄质循环相关基因序列设计引物,采用PCR技术克隆到相关基因翻译起始位点ATG上游启动子序列,克隆了三个关键酶(ZEP、NCED和VDE)基因,并进行了分子生物学分析。高盐胁迫或低温逆境下PS Ⅱ实际光化学效率(ΦPS Ⅱ)下降、PS Ⅱ还原性增强、非光化学淬灭(NPQ)增加。与低温逆境相比,高盐胁迫导致PSⅡ实际光化学效率(ΦPSⅡ)下降得更多,PS Ⅱ更还原,非光化学淬灭(NPQ)上升的幅度更少。外源ABA可减少PSⅡ实际光化学效率(ΦPS Ⅱ)下降,减轻PS Ⅱ的还原状态,并增加非光化学淬灭(NPQ)容量。因此,低温逆境水稻较高盐胁迫水稻,ABA预处理水稻较非ABA预处理水稻有更高的光合电子传递活性(P),更多的能量耗散(D)和更少的过量光能(E)积累。外源ABA可增大水稻叶片中紫黄质循环库,促进紫黄质循环组分中紫黄质脱环氧化作用,通过改变紫黄质循环动力学提高非光化学淬灭(NPQ)水平。外源ABA和紫黄质循环介导的非光化学淬灭(NPQ)之间的协同作用可保护水稻叶片在高盐胁迫/低温逆境下免受氧化伤害。高盐胁迫(—ABA+SS)下(?)(?)CED4基因,低温逆境(—ABA+LT)下NCED5和NCED4基因表达上调,分别为7.579、3.777和3.589倍。另外,高盐胁迫*低温逆境下8’OX1基因的表达量分别高达13.874和51.253倍,VDE基因的表达量分别达2.326和2.956倍,ZEP基因的表达量分别达2.985和1.874倍。NCED、8’OX、VDE和ZEP酶分别是ABA合成、ABA分解和紫黄质循环的关键酶,高盐胁迫/低温逆境能诱导ABA的代谢和紫黄质循环。外源ABA能明显增加+ABA+SS、+ABA+LT水稻叶内上述基因的表达量。在高盐胁迫(—ABA+SS)、低温逆境(—ABA+LT)、或在添加外源ABA的高盐/低温(+ABA+SS和+ABA+LT)条件下,ZEP(LOC_Os04g37619)基因的表达均明显上调。该基因上游序列中有ABRE、MYC/MYB、DRE和EP2等顺式作用元件,其表达可能受依赖于ABA(如ABRE、MYC/MYB元件)或不依赖于ABA(如DRE元件)的非常复杂的网络体系调控。NCED4基因、(?)(?)CED5基因、8’OX1基因、VDE基因对高盐胁迫、低温逆境、添加外源ABA等均有不同程度的敏感性,其表达量均有不同程度的增加。ZEP酶的N-末端有一段脂溶性的“β片层-套环-α-螺旋”结构,NCED酶蛋白N-末端有一段两性(脂溶性和水溶性)α-螺旋,VDE序列中含有保守的4个His残基和高电荷C-末端区,上述酶的这些特性与水稻在特定条件下通过调节酶的催化活性来适应变化了的环境有关。ABA代谢及紫黄质循环相关酶活性受基因转录、转录后修饰、酶分子的脂溶性和水溶性、酶分子所在溶液的pH值等的调节。第三,高盐/低温胁迫下ASC的氧化还原状态及相关基因/蛋白质表达分析。为了解逆境对水稻叶内抗坏血酸含量及氧化还原状态的影响,分别以高盐和低温胁迫为例,研究了它们对水稻叶内抗坏血酸、脱氢抗坏血酸含量以及单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(GLDH)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)等四种酶活性及其相关基因表达的影响。结果如下：逆境下水稻叶内H2O2含量逐渐增加,ASC/DHA比值不断下降,且下降的幅度明显大于对照。ASC/DHA比值是水稻叶内抗氧化系统清除活性氧潜力的一个重要指标。MDHAR酶和DHAR酶分别催化MDHA和DHA还原生成ASC。逆境下编码MDHAR酶的5个基因中有2个基因表达上调,编码DHAR酶的2个基因中有1个基因表达上调。逆境下MDHAR酶和DHAR酶活性均有不同程度的增加,其变化趋势与相关基因表达量的变化趋势一致。GLDH酶催化半乳糖酸-1,4-内酯脱氢生成ASC,是ASC生物合成途径中最后一步反应的关键酶。GLDH酶位于线粒体内膜,是膜结合酶。编码GLDH酶的基因在逆境下表达上调,与GLDH酶活性增加的变化趋势一致。APX酶催化H2O2还原为H2O,同时将ASC氧化为DHA,是清除H2O2,影响ASC/DHA比值的重要酶。逆境下编码胞质APX(APX1和APX2)的2个基因中有1个表达明显上调,编码过氧化物体APX(APX3和APX4)的2个基因略有上调,编码叶绿体基质APX(APX5、APX6和APX7)和1个类囊体膜结合APX(APX8)基因均有不同程度的下降。通过同源建模,构建了APX酶的3D结构。APX酶含血红素辅基,近端组氨酸的咪唑N是血红素Fe(Ⅲ)的第五个配体、远端组氨酸位于血红素辅基与H2O2结合的一侧,离血红素稍远,不与血红素Fe(Ⅲ)成键,它是酶催化中心的活性位点,具有接受质子的功能。当APX与底物H2O2结合成为酶-底物复合体时,血红素Fe(Ⅲ)的第六个配位位置被H2O2分子占据。APX酶的第二个底物是ASC,位于血红素辅基卟啉环γ位,与丙酸侧链以氢键相连,并与相邻R173/R179的胍基有两个氢键相连,还与相邻K31/T29的ε-氨基/β-OH以氢键相连。ASC不仅是抗坏血酸过氧化物酶的底物之一,而且在维持抗坏血酸过氧化物酶空间构象方面起着非常重要的作用。与胞质APX和过氧化物体APX相比,叶绿体基质APX和类囊体膜结合APX分子中另有一个突环结构。组成突环的氨基酸残基中,所有极性不带电荷氨基酸位于突环结构的内部,且在ASC结合位点的附近形成了一个极性、中性的微环境,这种极性、中性的微环境有利于叶绿体基质APX和类囊体膜结合APX在光下偏碱性(pH8左右)的基质溶液中进行催化反应。通过对胞质APX2基因和类囊体膜结合APX8基因的原核表达研究表明,APX2蛋白和APX8蛋白的分子量分别为28.2kD和44.7kD。动力学分析表明,APX酶催化的生化反应是双底物(ASC和H202)乒乓反应,APX2酶和APX8酶对ASC和H202底物分别有不同的Km值。进一步研究APX酶在不同pH反应液中酶催化活性的变化,发现APX2酶和APX8酶的最适pH分别在6-7和7-8左右。APX8酶的最适pH在7-8左右,进一步证明由突环构建的极性、中性微环境,对叶绿体APX在偏碱性基质中完成催化反应的保护作用。逆境下ASC的氧化还原状态(ASC/DHA比值)的变化是MDHAR基因/酶、DHAR基因/酶、GLDH基因/酶、APX基因/酶共同作用、以及叶绿体和线粒体等细胞器协调作用的结果。综上所述,本文从转录、转录后等不同水平上研究了ABA-紫黄质循环、氧化还原平衡介导的ROS清除系统之间的关系,并筛选候选基因进一步在生物化学和分子生物学水平上探明这种关系。这对于通过基因工程手段辅助植物育种、培育抗氧化逆境的优良种质具有重要意义。