第一部分氨肽酶N的研究背景氨肽酶N (Aminopeptidase N, APN, CD13)是锌离子依赖性金属蛋白酶M1家族的一种膜结合型外肽酶,以同源二聚体的形式跨膜结合于细胞表面。肿瘤细胞生物学研究表明,氨肽酶N高表达于多种恶性肿瘤细胞,通过其蛋白水解酶功能,在恶性肿瘤的侵袭、转移和血管生成等过程中通过降解细胞间基质,对肿瘤的增殖和侵袭转移起着促进的作用。研究证明,APN在肿瘤发生发展中的重要作用包括：(1)降解细胞间基质,直接促进肿瘤细胞的侵袭与转移；(2)降解细胞间基质,因而造成多种生长因子的释放,促进肿瘤细胞增殖；(3)刺激与血管生成相关的细胞因子的释放,促进肿瘤血管内皮细胞管状结构的形成。血管生成是一个非常复杂的过程,仅发生于新生儿、成人愈伤时期或恶性肿瘤。当原发或继发肿瘤的体积超过1～2 mm3时,必须发展新生血管提供足够的血液供应,才能够继续增殖；肿瘤的转移也往往伴随血管生成。血管生成包括内皮细胞透过基底膜侵袭、转移、粘附和增殖等过程,并最终在肿瘤组织内形成网络结构。细胞间基质的主要成分是胶原蛋白、硫酸乙酰蛋白聚糖、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白等,通过以胶原蛋白和蛋白聚糖为基本骨架的纤维网状复合物,在细胞之间相互联系,维持细胞连接的稳定性和襄助细胞间的信号转导。同时,这也成为了肿瘤细胞转移的障碍,因此降解和侵袭基底膜是肿瘤细胞转移和新生血管生成的第一步。由于APN与肿瘤的生长、侵袭、转移和血管生成关系密切,因此靶向于APN的药物已成为抗肿瘤侵袭、转移和抗血管生成方面研究的热点。从网状橄榄链霉菌培养液中提取的天然产物Bestatin被发现能够抑制APN的活性,其作为免疫增强剂于1987年在日本上市。至今,许多国家的学者仍在致力于研究其在高剂量下作为APN抑制剂时对肿瘤转移和血管生成的作用,并且已经取得了一定的进展。第二部分目标化合物的合理设计与合成本研究的特色在于,运用类肽设计的原理,以脲基代替传统天然肽类化合物的酰胺键(肽键)作为连接基团,以非肽化学基团取代天然肽类化合物的氨基酸残基作为改良后的药效团,连接APN天然底物中水解频率较高的碱性或中性氨基酸残基,构建了小分子脲基类肽化合物库；将计算机虚拟对接与活性测试实际结果相结合,对化合物进行结构改造和优化,包括对连接部分和侧链进行合理设计,并实现定向合成。本研究中所设计的化合物,经过几轮结构改造,得到了抑酶活性明显提高的一类先导化合物,并对活性较好的几个化合物在抗肿瘤转移和抗血管生成方面进行了进一步的抗肿瘤机制研究和动物体内药效学研究。所得结果有助于日后进一步优化APN抑制剂的骨架和药效团,建立完整的APN抑制剂的抗肿瘤机制评价研究和体内药效学模型。本文中所设计的化合物具有进一步开发的价值。本文在基于生物靶标的合理药物设计的基础上,本着结构多样性的原则,对化合物进行了包括侧链、取代基和连接基团在内的三个方面的结构优化,设计了两种合成工艺路线,完成了三个系列82个目标化合物的合成。合成方法充分体现了小分子类肽合成的优势,工艺路线切实可行,转化率和分离收率较高。本文以两种合成方法完成了对三个系列目标化合物的合成：(一)、为了探讨氨基酸侧链和非肽取代基团部分不同取代基对活性的影响,我们采用不同的脂肪胺或芳香胺为起始原料,经三光气转化为异氰酸酯,然后与不同的氨基酸甲酯以脲基相连接,再将甲酯转化为异羟肟酸,得到目标产物；(二)、为了探讨不同的连接基团或氨基酸侧链、以及锌离子螯合基团(ZBG)对活性的影响,我们采用了以氨基酸甲酯盐酸盐为起始原料,经三光气转化为异氰酸酯,然后与不同的醇或氨基酸甲酯以氨基甲酸酯或脲基相连接,再将甲酯部分保留或转化羧酸或者为异羟肟酸,得到目标产物。对于所得的化合物结构,通过核磁共振氢谱、碳谱、高分辨质谱确证；纯度经元素分析和高效液相色谱法检测,均为95%以上。经文献检索证实,所合成的目标化合物为新化学实体,未见文献报道。第三部分目标化合物的体内外生物活性评价及其抗肿瘤机制研究本文设计合成了三个系列共82个小分子类肽化合物,并对其针对猪肾来源的APN (microsomal,sigma)的抑酶活性进行了初步筛选。针对初步筛选中得到的活性优于阳性对照bestatin(乌苯美司)的化合物,则对其抑酶活性进行了进一步的研究,包括其对高表达APN的小鼠黑色素瘤细胞B16BL6和人卵巢透明细胞癌细胞ES-2细胞表面APN酶活的抑制能力、对这两种细胞生存能力的影响,和对同为锌离子依赖性金属蛋白酶和细胞间基质(ECM)水解酶的基质金属蛋白酶MMP-2酶活性的选择性进行了研究。以上筛选所得到对APN活性最优、选择性最高并且对两种肿瘤细胞生存影响最小的化合物,则对其进行进一步的抗侵袭和抗血管生成机制研究。根据机制研究的结果,挑选最优者进行体内抗转移和抗血管生成药效学研究。酶抑制活性测试显示,ZBG的有无和螯合强度对活性的影响很大,连接部分、氨基酸侧链和非肽基团的结构对活性也有重要的影响。78个化合物中约有一半的酶抑制活性要优于阳性对照乌苯美司,其中十多个化合物的半数抑制浓度(ICso)低于乌苯美司一个数量级或以上。这说明脲基类肽化合物作为小分子APN抑制剂具有很大的潜力。并且,活性最优的几个化合物对MMP-2抑制活性很低甚至没有,说明其具有很好的靶点选择性；对两种肿瘤细胞的生存能力在很高的浓度几无影响,其用MTT法所测得的半数生长抑制浓度(GIso)均大于已上市的乌苯美司,说明可能是一类非细胞毒类化合物。体外机制研究包括两部分,抗侵袭和抗血管生成。抗侵袭研究采用的是包被Matrigel的transwell法；抗血管生成采用的则是大鼠主动脉环微血管生成测试和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)成管腔测试,也需以Matrigel为基质。Matrigel是小鼠EHS肉瘤所分泌的细胞间基质,是用于代替ECM进行多种相关的体外机制研究的商品化产品。抗侵袭测试的结果表明,脲基类肽3-11、3-19、3-36、3-34、3-40和3-45可以在对细胞迁移能力几无影响的情况下显著抑制恶性肿瘤细胞ES-2的侵袭,结果具有统计学意义。大鼠主动脉环和HUVEC成管腔测试的结果显示,脲基类肽3-11、3-19、3-36、3-40和3-45具有显著的体外抗血管生成作用。脲基类肽化合物的体内抗转移和抗血管生成药效学试验采用了两种模型,分别为人工肺转移模型和肿瘤引发的皮内血管生成模型。两种模型选择的动物为C57BL/6小黑鼠,瘤株为B16BL6小鼠黑色素瘤。体内药效学实验结果显示,脲基类肽3-36、3-40和3-45可以较为显著地抑制小鼠黑色素瘤人工肺转移结节的形成,抑制率分别为33.5%、37.7%和50.3%；脲基类肽3-36、3-40和3-45在抗血管生成模型中也能够明显地抑制肿瘤细胞引发的血管生成,抑制率分别为61.7%、57.5%和67.8%。体内药效学试验所选择的3个化合物其在抑酶活性、体外机制研究和体内药效学测试中的表现具有良好的相关性,活性均优于阳性对照乌苯美司,表明此3个化合物具有成为抗肿瘤候选药物的潜力。第四部分目标化合物的构效关系研究我们选择了在抑酶活性初筛中获得的三个代表性的脲基类肽小分子APN抑制剂1-18、3-11和3-45,对它们进行虚拟对接研究,以期考察其与靶点的结合模式,指导下一步的化合物设计和修饰改造。虚拟对接以Eoli的APN(eAPN)的晶体结构作为受体,在还原晶体复合物结构中Bestatin的构象后,则以该对接条件对这三个化合物进行对接。对接发现,化合物1-18和3-11均采取了与Bestatin相似的结合模式,而化合物3-45的萘基部分则延伸向了不同的方向。我们推测,这可能成为化合物1-18和3-11具有较好的抑酶活性、以及抑酶活性在化合物3-45上出现突破的原因。第五部分结论本课题所设计的脲基类肽小分子APN抑制剂具有很好的APN抑酶活性。我们在体外机制研究和体内药效学研究方面主要集中于APN作为肿瘤细胞表面标记物和降解ECM的金属蛋白酶所发挥的生理和病理功能,即肿瘤转移和肿瘤引发的血管生成,建模成功并且取得了显著的抗肿瘤结果。体内外研究结果显示,脲基类肽化合物具有作为先导物进行进一步研究开发的价值,从而为发现具有临床治疗用途的抗肿瘤转移和抗血管生成创新药物奠定了基础。