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目的：美洲商陆抗病毒蛋白Ⅰ(Pokeweedantiviralprotein，PAPⅠ)是核糖体失活蛋白的一种，分子量29kDa，它能够攻击真核细胞28S和原核细胞23S核糖体RNA，并且从核糖体RNA保守的S/R区移去特异的一个腺嘌呤碱基而使EF2延伸因子无法正常行使功能，蛋白合成受到抑制。类似于其他的核糖体失活蛋白，美洲商陆抗病毒蛋白有很强的细胞毒性，能够诱导细胞凋亡和死亡。PAP能够抑制HIV-1病毒的复制已经发现多年，最近，Au等发现Luffin-a等核糖体失活蛋白能够强烈抑制HIV-1病毒的整合，可能有临床应用前景。本研究旨在利用基因工程方法克隆美洲商陆抗病毒蛋白Ⅰ的基因，构建其表达载体，并获得有活性蛋白，并研究美洲商陆抗病毒蛋白的生物学活性以及与HIV-1长末端重复序列(LTR)的相互作用。
方法：根据报道的cDNA序列，设计合成两条引物，在两条引物上分别添加NdeⅠ酶切位点，TGA终止密码子和HindⅢ酶切位点，用RT-PCR的方法从美洲商陆春叶中克隆PAPⅠ基因，与pMD18-TSimpleVector连接，连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，挑取白色单克隆菌落扩增，少量抽提质粒，NdeⅠ和HindⅠⅡ双酶切鉴定。对确实含有外源片段的阳性亚克隆测序，用限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ对测序结果满意的亚克隆产物进行双酶切，目的基因片段切胶回收，与经相同酶切的pET44a-c(+)载体连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂LB平板，挑取转化成功单克隆菌落扩增，少量抽提质粒，双酶切、小量表达鉴定重组质粒。将含有正确表达载体pET-44a(+)-PAPⅠ的转化菌BL21(DE3)IPTG诱导表达，收集菌体沉淀，将沉淀超声破菌，将超声所得沉淀反复洗涤，尿素溶解包含体，透析复性。复性蛋白溶液用Blue-Sepharose6B亲和层析纯化，经SDS-PAGE电泳检测，用MTT法检测细胞毒性。用统计学方法比较PAPⅠ组和RTA组(对照组)细胞存活率的差异。琼脂糖凝胶电泳检测蛋白的DNA酶作用，ELISA方法验证其与LTR的相互作用，分子模拟的方法建立美洲商陆抗病毒蛋白与LTR作用的模型。
结果：PCR产物经1％琼脂糖电泳，溴乙锭染色后，在紫外光下可见一条明显的约800bp的亮带，与预计的目的片段长度大小一致。目的片段与T载体连接产物转化感受态JM109，长出白色克隆，抽提质粒用NdeⅠ和HindⅢ双酶切确认外源片段插入，经测序证实该片段序列与所报道的PAPⅠ核苷酸序列基本一致。重组质粒pET-44a(+)-PAPⅠ用NdeⅠ和HindⅢ双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳。可见大小约5500bp和800bp的两个片段，说明PAPⅠ的编码基因已插入pET-44a-c(+)。含重组子pET-44a(+)-PAPⅠ的大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达，菌液及菌体超声破菌后沉淀和上清12％SDS-PAGE电泳，经诱导菌液泳道及超声沉淀泳道均可见一分子量约为29kD的蛋白条带，与PAPⅠ的分子量吻合，而未诱导菌液与超声上清无相应条带，这说明PAPⅠ以包含体形式正确表达。包含体反复洗涤后纯度达70％以上，尿素溶解，透析复性所得产物纯度约30％，复性率较低。复性液经Blue-Sepharose6B纯化，SDS-PAGE检测，结果显示其纯度大于90％。MTT法进行毒性检测，表明复性纯化后的PAPⅠ具有与蓖麻毒素A链(RTA)相似的细胞毒性。纯化的美洲商陆抗病毒蛋白Ⅰ对癌细胞有明显的杀伤作用，能够作用与超螺旋DNA具有核酸内切活性，与LTR能够相互作用。
结论：本实验采用RT-PCR的方法，从美洲商陆春叶中克隆得到了正确的PAPⅠ基因，并将其插入到载体质粒pET-44a(+)中，成功构建了PAPⅠ的表达质粒pET-44a(+)-PAPⅠ。重组质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG诱导下，表达出分子量约为29kD的蛋白质，与目的蛋白分子量一致。而蛋白质电泳表明目的蛋白主要以包含体形式表达，所得包含体经反复洗涤后纯度可达70％以上。洗涤后的包含体经尿素溶解，透析复性，可得到少量的复性蛋白，纯度在30％左右。复性液经Blue-Sepharose6B亲和纯化法，得到90％以上的纯度。MTT法测定PAPⅠ和RTA蛋白对不同细胞的毒性作用，结果表明两者具有相当的细胞毒性。美洲商陆抗病毒蛋白能够与LTR相互作用，可能通过竞争结合LTR或改变LTR构象抑制整合。