论文部分内容阅读
由尖孢镰刀菌古巴专化型[Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder et Hansen]引起的香蕉枯萎病是严重制约香蕉生产的毁灭性病害。milRNA(microRNA-like)在真菌的生长发育过程中起到了重要的调控作用。有关其生物合成及作用机制通路中的重要组分如Dicer酶、Argonaute(AGO)蛋白等的功能在粗糙脉孢菌和禾谷镰刀菌等真菌中有研究报道,但在香蕉枯萎病菌中这些通路中相关蛋白的功能尚不明确。为探究香蕉枯萎病菌milRNA生物合成及作用通路中重要蛋白的合成基因的功能,本论文以前期研究中筛选得到的Dicer蛋白合成基因DCL1和DCL2的敲除突变体?DCL1-1和?DCL2-1以及AGO蛋白合成基因QDE2的敲除突变体?QDE2-6为研究对象,研究分析了DCL1、DCL2、QDE2基因在香蕉枯萎病菌中与致病相关表型及milRNA合成与积累,并通过基因回补获得QDE2基因互补转化子HB?QDE2-21及HB?QDE2-47,进一步对QDE2基因的功能进行了验证,主要结果如下:1.对可能参与milRNA生物合成与作用通路中的三个基因敲除突变体的表型分析发现,突变体?QDE2-6在菌落形态、生长、产孢、孢子的耐热性、对过氧化氢的敏感性、对长波和短波光照的敏感性以及致病力等表型上均与野生型菌株XJZ2存在显著差异;milRNA的qRT-PCR结果显示,QDE2基因敲除突变体中检测的大部分milRNAs表达量显著下降。而通路中另外两个基因敲除突变体与野生型相比,除?DCL1-1的孢子耐热性和致病力有轻微下降外,其他表型变化不显著。2.通过构建Argonaute蛋白的系统发育树,分析了AGO蛋白在不同真菌间的系统进化关系。在大部分的真菌中,都有两个AGO蛋白,少数真菌有3-5个AGO蛋白;香蕉枯萎病菌的QDE2与粗糙脉孢菌QDE2、禾谷镰刀菌的FgAgo1以及来自稻瘟病菌的AGO蛋白聚在一个分支上,说明他们具有相同的起源;而尖孢镰刀菌自身的AGO蛋白极为紧密的聚集在一起,说明种内进化较为一致。3.为进一步研究QDE2在香蕉枯萎病菌中的具体功能,我们构建了QDE2基因互补载体,运用PEG介导的转化法,成功获得QDE2基因互补突变体HB?QDE2-21及HB?QDE2-47。通过对QDE2基因敲除突变体和互补转化子的表型分析,结果发现与QDE2基因敲除突变体相比,互补转化子HB?QDE2-21及HB?QDE2-47的气生菌丝增多,产孢量有所增加,对过氧化物的抗性增强,致病力明显增强,可见QDE2基因回补后,突变体的表型能够恢复或部分恢复至野生型的表型,说明在香蕉枯萎病菌中QDE2具有影响生长、产孢和致病力的功能。4.在实验室前期研究基础上,根据预测的milRNAs设计特定的检测引物,对目标milRNAs的表达量进行检测。结果显示在突变体?DCL1-1、?DCL2-1和?QDE2-6中均有部分milRNAs的表达量显著下降,进一步对QDE2基因互补转化子HB?QDE2-21及HB?QDE2-47中目标milRNAs的表达量检测发现,原本在QDE2基因敲除突变体中表达显著下降的milRNAs,在互补转化子中的表达量基本恢复至野生型的水平,表明这部分milRNAs是依赖于QDE2基因产生的。上述结果表明,香蕉枯萎病菌QDE2基因除了可以参与部分milRNAs的合成外,还影响病原菌的生长、产孢以及对寄主香蕉的致病力。