白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是一种引起对虾爆发性死亡的病毒,因其传播速度快、宿主范围广、致死率高等特点,已成为对虾养殖业严重病害之一。目前全球已研制出多种药物,如各种重组疫苗(DNA疫苗、RNA疫苗和蛋白亚单位疫苗)等,在实验室水平均有成效。然而,至今尚未见可在养殖业规模应用。我们研究集体已根据WSSV主要囊膜蛋白VP28在防治WSSV中的重要作用,用蓝藻这一原核表达系统表达VP28蛋白,经实验验证可有效免疫对虾虾苗。基于我们研究集体十几年来的研究进展,本学位研究着重关注这种重组疫苗产业化过程中产品的稳定性和安全性,得到以下主要结果:(1)针对本疫苗在中试生产中发生目的基因丢失的情况,对重组载体质粒(携带目的基因)的稳定性作了分析。关键重组载体质粒pRL-489-vp28和pGM-T-WSSV-vp28在转化大肠杆菌TOP10后,通过不同抗生素压力筛选得到保持良好稳定性条件。发现前者超过10 h,后者超过7 h后,质粒损失率均迅速大于10%。培养10-16个小时后,转化大肠杆菌菌液OD600值可达1.2-2.8之间,有效细菌平均却只在60%-85%之间。因此,本研究把初始培养抗生素压力分别提高至Amp剂量200mg/mL和Kana剂量200mg/mL,可有效提高转化大肠杆菌中pGM-T-WSSV-vp28与pRL-489-vp28重组载体质粒相对稳定性至85%和90%。再将转入重组载体质粒pRL-489-vp28的转vp28基因蓝藻,在有无选择压力下继代培养,发现有选择压力(Kana终浓度为200μg/mL)可以使其稳定性在10代后仍有60.8%。(2)针对本疫苗产品在市场操作中,要经历较长时间才到现场使用,这就需保证在现场使用前有效成分VP28蛋白不分解或少分解、质量有效,研究连续三批重组疫苗在不同储存温度下的药效蛋白稳定性。采取处理后多项指标检测的方法,即用RT-qPCR、Western Blot等手段检测重组疫苗有效成分VP28含量变化;用生物学活性实验检测重组疫苗免疫处理后攻毒南美白对虾存活率。实验结果表明,-80℃贮存6个月的重组疫苗,其VP28蛋白含量比-20℃样品高26.5%,比4℃样品高34.3%。口服药效实验证明,-80℃贮存的本疫苗应用于对虾抗WSSV,存活率高达85%。可证明重组疫苗储存在此温度下六个月内,有良好稳定性,且还能促进对虾生长,这是“药食同源”的有力证明。(3)针对本疫苗产品是口服剂,在饲喂时部分产品可能残留在养虾池,会造成转vp28基因蓝藻在环境中释放的问题,需对产品中转基因蓝藻作预处理。本研究采用冻融法可使重组疫苗在保证其安全性的条件下,不丢失有效成分VP28蛋白。即藻泥状产品在-20℃下反复冻融3次(每次冷冻24 h,室温16℃解冻5 min),可使转基因蓝藻细胞100%损伤,无繁殖能力且不丢失重组疫苗有效成分。这些表明了这种冻融法可控制转vp28基因蓝藻抗WSSV重组疫苗即保证药效稳定又可不在环境中释放。综上可见,我们用200mg/mL浓度的抗生素可保障所使用重组载体质粒的稳定性,避免目的基因丢失;重组疫苗在-80℃贮存6个月可保证其稳定有效;如果转vp28基因蓝藻在制成口服疫苗产品前,经过-20℃—室温的冻融处理,可确保饲喂对虾后残留养虾池里的产品不在环境中释放,不影响生态平衡。考虑商业化生产、规模化使用时的操作成本、设备利用率等条件,进行转vp28基因蓝藻口服疫苗产品生产时,将产品离心脱水为藻泥,于-20℃下反复冻融3次(每次冷冻24 h、解冻5 min),并于-80℃冷藏半年以内,作为保证转vp28基因蓝藻抗WSSV重组疫苗稳定性与安全性的优选方法。此外,使用反复冻融法防止转基因生物药物使用时在环境中释放尚未见其他报道,这可为其他转基因蓝藻在环境中的安全释放和稳定性保证提供借鉴。该方法操作简便又少药效损失,是冻融法在应用范围上的扩大;也可保证重组疫苗稳定性,在防治WSSV提供安全保障。