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肥胖是由于动物体内以司能量储存为主要功能的白色脂肪细胞过度肥大和异常增殖、分化导致的。哺乳动物体内的棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)作为产热组织,可帮助机体增加耗能,维持能量代谢平衡。人体内BAT呈散在分布,在健康成人体内其含量仅不足50克,远远少于占其体重20%左右的白色脂肪组织。如能充分利用体内白色脂肪细胞含量丰富、可塑性强的特点,使其转化为棕色样脂肪细胞(白色脂肪细胞棕色化),从而增加机体能量消耗、改善胰岛素抵抗,将为抗肥胖及其相关疾病提供新的思路。因此,首先需要明确白色脂肪细胞棕色化的影响因子及其调控机制。国内外学者的研究显示,在动物白色前脂肪细胞成脂分化以及成熟脂肪细胞去分化过程中,胰岛素信号通路均发挥重要调控作用。那么,胰岛素信号是否同样在白色脂肪细胞棕色化中发挥作用呢?其影响白色脂肪细胞棕色化的特征及其分子机制是怎样的呢?本文针对这些问题,设计了相关实验,以期初步阐明胰岛素信号在白色脂肪细胞棕色化过程中的作用特点及其调控机制。本实验野生型(wild type,WT)和瘦素受体基因(db)自然点突变db/db肥胖小鼠原代皮下脂肪干细胞(adipose stem cells,ASCs)(msASCs)和内脏ASCs(meASCs)以及人皮下ASCs(hsASCs)为实验材料,采用本实验室优化的结合低温处理的白色脂肪细胞棕色化联合诱导法,开展后续实验。为研究胰岛素信号在白色脂肪细胞棕色化中的作用机制,使用胰岛素信号特异性抑制剂(Iinstinib,OSI-906)抑制该信号通路,设置1)单纯诱导组(胰岛素信号非抑制)和2)胰岛素信号抑制组,通过检测细胞形态学以及棕色化标志因子、胰岛素信号通路关键分子以及成脂关键分子的转录及翻译水平变化特征,分析胰岛素信号与白色脂肪细胞棕色化的相关性,初步探讨其分子机制。实验结果如下所述。1.首先确定人和小鼠ASCs体外棕色化最佳诱导方法。参考前人的棕色化诱导方法并加以改进对WT msASCs、meASCs和hsASCs进行棕色化诱导,检测其棕色化标志分子翻译水平表达(WB),结果表明,我们改进的棕色化诱导方法均能够使msASCs、meASCs和hsASCs发生一定程度的棕色化,其中msASCs棕色化程度高于meASCs,选择msASCs和hsASCs作为后续实验材料。此外,为进一步提高棕色化诱导程度,我们还分别于诱导msASCs和hsASCs棕色化的不同时间点对其进行26℃低温处理。结果表明,低温可显著促进两种ASCs的棕色化,其程度随低温处理时间延长而增加,因此后续实验将采用本实验优化的此联合诱导方法。2.以msASCs和hsASCs为实验材料,筛选胰岛素信号抑制剂OSI-906最适使用浓度,分别设置浓度梯度为0、0.5、1和1.5μM。诱导结束后进行尼罗红染色,观察棕色化成脂情况,同时以胰岛素信号通路中关键分子AKT的磷酸化作为抑制胰岛素信号程度的检测指标。结果表明,OSI-906呈剂量依赖性抑制AKT磷酸化,当添加1.5μM的OSI-906时,其对msASCs和hsASCs中pAKT的抑制程度最高(91%和87%)。鉴于高浓度OSI-906可能对细胞的毒副作用,因此,后续实验将以1.5μM OSI-906作为最终浓度使用。3.为探讨胰岛素信号与不同状态和种属动物白色脂肪细胞棕色化的相关性,本实验以WT、db/db msASCs和hsASCs为实验材料,采用联合诱导方法诱导其棕色化,设置单纯诱导组和胰岛素信号抑制组,对细胞形态以及细胞棕色化相关分子时序性表达变化特征进行检测分析,结果显示,阻断胰岛素信号后,上述细胞棕色化成脂均受到显著抑制,成脂率由单纯诱导组的60±5.5%降至抑制后的5±2.5%;棕色化相关因子UCP1、PGC-1α和PRDM16的转录及翻译水平均显著下调;此外成脂关键分子PPARγ和C/EBPβ也明显下调。本实验中胰岛素信号抑制组仍保留一定程度的棕色化水平,推测可能是由于除胰岛素信号尚未完全阻断的原因之外,还有其他信号通路参与白色脂肪细胞棕色化调控。因此,针对与胰岛素信号通路相关、且参与白色脂肪细胞棕色化过程的分子AMP蛋白激酶(AMP activated kinase,AMPK)、Sirtuin1蛋白(sirtuin type 1,SIRT1)进行了检测,结果显示抑制胰岛素信号通路可在原有基础上进一步显著促进AMPK磷酸化,并上调SIRT1的转录和翻译水平,代偿性地维持其棕色化水平。综上,实验结果表明:胰岛素信号正向调控白色脂肪细胞棕色化,其既可加快棕色化成脂进程,又促进棕色化水平。此外,基于本实验中WT、db/db msASCs和hsASCs中上述检测结果无明显差异,我们认为胰岛素信号与WAC棕色化调控现象,不受基因型以及物种的影响,具有普遍意义。