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目的研究PIN1基因扩增和表达,探讨其在喉癌发生发展中的作用。材料与方法一、标本来源及制备40例标本均来自于中国医科大学附属第一医院。患者经病理诊断为喉鳞状细胞癌首发病例,术前未经过放化疗。其中高、中分化29例,低分化11例;临床分期Ⅰ期19例,Ⅱ期12例,Ⅲ、Ⅳ期9例。患者年龄41～79岁,平均年龄61.9岁。术后标本立即取部分用于实体瘤细胞原代培养,其余储存在-70℃冰箱中。取冻存肿瘤标本,作4μm连续切片,行免疫组化染色,镜下选择间质细胞少于10%的癌巢区,做好标记。然后从癌巢区取材,同时取距癌巢2cm以上的组织作为正常对照。将所取样品置液氮中速冻后锤击粉碎,收集于2.0ml Eppendorf管中,用于组织DNA、RNA和蛋白质的提取。二、方法取40例术前未经放化疗的喉鳞状细胞癌患者手术标本的癌组织和癌旁正常组织配对进行以下实验:1、提取DNA,采用差异PCR方法检测喉鳞癌组织中PIN1基因在分子水平的扩增情况;2、取术后新鲜喉癌及其配对组织进行实体瘤细胞原代培养及核型分析,检测19号染色体数目;3、提取组织总RNA,反转录合成cDNA,利用半定量RT-PCR的方法以β-actin为内参,癌旁正常组织为对照,分析PIN1基因在喉鳞癌组织中的mRNA表达水平;4、免疫组织化学方法检测40例喉癌及其配对组织冰冻切片中PIN1蛋白表达水平;5、提取组织总蛋白,利用Western Blot方法以β-actin蛋白为内参,癌旁正常组织为对照,分析PIN1蛋白在喉鳞癌组织中的表达情况。结果1、采用差异PCR方法检测PIN1基因扩增情况,结果发现在40例喉鳞癌患者的手术标本中有9例存在扩增,占22.5%(X~2=29.032,P＜0.005),有统计学意义。2、实体瘤细胞培养核型分析结果在17例标本中发现3例19号染色体增加,占17.65%,利用Fisher确切概率法进行分析,P＜0.05,有统计学意义。3喉癌组织PIN1基因mRNA表达与β-actin表达平均积分光密度比值为1.220±0.490,癌旁正常组织为0.790±0.154。其中67.5%(27/40)喉癌组织PIN1基因mRNA过表达(X~2=11.077,P＜0.005),有统计学意义。4、免疫组织化学结果显示40例中有29例PIN1蛋白过表达,占72.5%(X~2=9.091,P＜0.005),有统计学意义。5、Western Blot分析发现在40例病例中有26例癌组织PIN1蛋白过表达,占65%(X~2=12.071,P＜0.005),有统计学意义。6、经spearman相关分析发现在喉癌组织中PIN1基因扩增和mRNA、蛋白过表达结果具有高度的一致性。7、对喉癌中PIN1基因扩增、mRNA、蛋白过表达结果与临床参数进行统计学分析,未发现显著相关(P＞0.05)。上述结果表明喉鳞癌组织中PIN1基因拷贝数增加是其mRNA、蛋白质过表达的原因之一;PIN1过表达在喉鳞状细胞癌发生的早期即发挥作用。结论基因扩增是PIN1过表达的原因之一;PIN1过表达在喉癌发生的早期即发挥作用,通过多条途径促进喉癌的发生和发展;靶向抑制PIN1的功能或减少其表达将有效地抑制这些致癌途径,为喉癌的基因治疗提供了新的靶点。