原发性肝癌(PHC)分为肝细胞癌(HCC，占95％)、胆管细胞癌(CCC，占3％)和混合型癌。HCC是常见的恶性肿瘤，高居中国癌症死亡率第二位，有病程短，手术切除率低，预后差的特点。手术切除肿瘤、经皮消融治疗和肝移植是治疗HCC的有效方法。但多数HCC患者就诊时已是中、晚期，肿瘤已有血管侵犯、肝内浸润和远处转移，只能行化疗、放疗等姑息性治疗。HCC对常规剂量的化疗药物不敏感，而更高剂量的化疗药物因毒副作用而使其应用受到限制。近年由于新化疗药物的出现和给药方式的改进(如经皮瘤内注射、经肝动脉导管持续灌注、肝段或亚肝段栓塞治疗及多种给药方式结合等)让人们对化学药物治疗肝癌的看法有所改变。临床医生、科研工作者正努力寻找有效的系统化疗方法。 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂(HMG-CoA还原酶抑制剂，statins)是一类广泛用于治疗高脂血症的药物，对心血管疾病有治疗和预防作用。自1976年从橘青霉中发现具有抑制HMG-CoA还原酶的活性物质美伐他汀以来，statins已有三代十余种。近年statins的抗肿瘤作用日益受到重视。临床前研究认为statins具有抗增殖、促进凋亡、抗侵袭及放射增敏作用。基础研究显示statins能抑制肿瘤细胞系增殖和动物模型肿瘤生长，而statins的抗肿瘤作用的临床Ⅰ、Ⅱ期研究也已见零星报道。多数报道认为statins的抗肿瘤机制可能与其非降脂作用有关。statins是HMG-CoA还原酶强力和高度专一的竞争性抑制剂，通过抑制甲羟戊酸通路的限速步骤而减少甲羟戊酸及其下游产物的生成，对细胞膜结构、信号传导、蛋白合成和细胞周期等重要细胞功能产生影响，进而调控肿瘤生成、生长和转移进程。 洛伐他汀(lovastatin，本文中简称LOV)是第一个用于临床的他汀类药物。本文拟以人肝癌HepG2细胞系为研究对象，不同浓度、不同作用时间的LOV及香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)、法呢酯焦磷酸(FPP)、PD98059为处理因素研究statins的抗肿瘤作用。用常规光学显微镜、荧光显微镜、电镜、平板克隆形成试验等观察细胞形态变化；用生长曲线、MTT试验观察细胞增殖抑制情况；用流式细胞仪检测细胞周期；用姬姆萨染色、荧光显微镜、DNAladder试验、AnnexinV-FITC法等检测细胞凋亡；用基因芯片、RT-PCR检测LOV作用前后的细胞基因差异表达；用Westernblot探讨一些细胞传导通路的作用。我们希望通过以上方法较全面地了解statins的抗肿瘤机制，为后续实验打下良好基础。 第一部分洛伐他汀的抑制HepG2细胞增殖作用目的：观察LOV对人肝癌细胞系HepG2细胞增殖的影响。方法：观察LOV作用于HepG2细胞前后光镜下细胞形态的变化；计算细胞数绘制细胞生长曲线；用平板克隆形成试验、MTT试验检测细胞增殖情况；流式细胞仪检测细胞周期，了解LOV是否有抑制HepG2细胞增殖作用，并了解LOV作用后细胞周期的改变及其对细胞增殖的影响。 结果：LOV能抑制HepG2细胞的增殖，随时间、浓度增加，效应更明显；LOV能使HepG2细胞的增殖阻滞于G0/G1期，随浓度增加，效应更明显；GGPP能完全逆转LOV的抑制细胞增殖作用，FPP能部分逆转LOV的抑制细胞增殖作用；ERK1/2的特异阻滞剂PD98059能使HepG2细胞的增殖阻滞于G0/G1期，与LOV合用，效应更为明显。 结论：LOV能抑制HepG2细胞的增殖，甲羟戊酸通路的类异戊二烯中间产物GGPP、FPP以及ERK的特异阻滞剂PD98059可能影响LOV的抗增殖作用。statins的抗肿瘤作用值得进一步研究。 第二部分洛伐他汀的促进HepG2细胞凋亡作用 目的：观察LOV对人肝癌细胞系HepG2细胞凋亡的影响。 方法：加入LOV、GGPP、FPP、PD98059，用姬姆萨染色、电镜、荧光显微镜、DNAladder试验及AnnexinV-FITC法检测HepG2细胞凋亡情况。 结果：LOV有介导HepG2细胞凋亡的作用，随时间、浓度增加，效应更明显；GGPP能完全逆转LOV的介导凋亡作用，FPP能部分逆转LOV的介导凋亡作用；LOV与PD98059合用可加强促凋亡作用。 结论：LOV能促进HepG2细胞的凋亡，与GGPP、FPP或PD98059合用对HepG2细胞的凋亡产生不同程度的影响。 第三部分洛伐他汀作用于HepG2细胞前后基因差异表达初步研究 目的：用基因芯片观察LOV作用前后HepG2细胞的差异表达基因。 方法：LOV20μmol/L作用于HepG2细胞18h，各提取实验组与对照组细胞总RNA，用cDNA直接标记法制备探针，进行杂交，杂交信号经扫描后，用软件分析基因表达情况。应用RT-PCR验证部分差异表达基因。 结果：共检出LOV作用后表达上调的基因30个，表达下调的基因11个，涉及信号传导、肿瘤免疫、细胞周期等方面，RT-PCR结果符合基因芯片结果。结论：用基因芯片筛选出的LOV作用后的肝癌细胞差异表达基因为深入研究他汀类药物的抗癌机制提供重要的理论依据。 第四部分RhoA和部分信号传导通路在洛伐他汀抑制HepG2细胞增殖中的作用 目的：探讨RhoA在LOV抑制HepG2细胞增殖过程中所起的作用，探讨Rho/ROCK和Raf/MEK/ERK信号传导在此过程中的作用。 方法：用基因芯片、RT-PCR和Westernblot检测LOV作用前、后HepG2细胞中RhoA的表达。用Westernblot检测ERK1/2和p38MAPK表达。合用ERK1/2的特异阻滞剂PD98059，用MTT试验检测LOV和PD98059的相互作用。 结果：加入LOV后，mRNA(RhoA)和RhoA蛋白水平均上调，加入GGPP或FPP后，RhoA蛋白水平上调被不同程度逆转。PD98059可以减少HepG2细胞的增殖，与LOV合用效果更明显。 结论：LOV抑制HepG2细胞生长的作用可能与RhoA的异戊二烯化有关，减少RhoA香叶酯化，抑制RhoA的细胞膜锚着可能是LOV抑制HepG2增殖的机制之一。Rho/ROCK通路可能在此过程中起主导作用，而Ras的异戊二烯化可能是一个辅助机制，Raf/MEK/ERK通路在一定程度上参与LOV的作用机制。ERK1/2传导途径可能对HepG2细胞的增殖有影响。 小结LOV能抑制HepG2细胞增殖，促进HepG2细胞凋亡，随时间、浓度增加，效应更明显；LOV作用后HepG2细胞中mRNA(RhoA)表达上调，细胞总蛋白中RhoA表达上调，随时间、浓度增加，效应更明显。GGPP能完全逆转LOV的介导的抑制增殖、促进凋亡作用，FPP部分逆转其作用；PD98059与LOV合用能增强LOV的介导的抑制增殖、促进凋亡作用。LOV抑制HepG2细胞生长的作用可能与RhoA的异戊二烯化有关，而Ras的异戊二烯化可能是一个辅助机制。ERK1/2传导途径可能对HepG2细胞的增殖有影响。statins的抗肿瘤作用研究尚待深入。今后的研究方向是：作用机制的研究；与化疗药物或其它分子靶向药物合用后的效应研究；作为放射增敏剂的研究；作为维持治疗药物及化学预防药物的研究等。