论文部分内容阅读
钙信号作为植物体内重要的信号转导分子,在植物生长发育、激素调节、免疫防御、生物及非生物胁迫等方面发挥着至关重要的作用。钙依赖性蛋白激酶(Calcium-dependent Protein Kinases,CDPKs)是主要的钙感受器,可不经钙调素作用直接被钙信号激活,参与调控多种胁迫转导途径,干旱、低温、盐等逆境因子的作用均能引起CDPKs基因的特异性表达。新疆是我国主要的棉花生产基地,由于其典型的干旱、半干旱气候特征,加之土壤盐碱化、倒春寒、秋季霜冻等不利环境因素很大程度上影响棉花的产量和品质,给棉花生产造成巨大损失。因此研究棉花中CDPKs基因的功能、揭示其抗逆机制,对改善植物抗逆性,加快抗逆品质培育具有重要的理论意义和实践意义。天山雪莲作为一种独特的逆境生长植物,具有极强的抗寒性,探索此类逆境植物中的抗逆基因是很有意义的。迄今,有关棉花CDPKs成员的鉴定和分析已有报道,但在雪莲中有关CDPKs基因的克隆和功能的研究还未见报道。为了探究两种不同生境植物CDPK1基因功能的异同,本试验分别从陆地棉和雪莲中克隆了钙依赖性蛋白激酶基因CDPK1,对Gh CDPK1和Sik CDPK1基因进行生物信息学分析及逆境胁迫下基因表达分析,并在转基因烟草中验证其干旱、高盐和低温抗性。主要研究结果如下:1、采用RT-PCR技术分别从冷敏感作物陆地棉新陆早33和高耐寒植物天山雪莲中成功克隆得到Gh CDPK1和Sik CDPK1基因(Gene Bank登录号为KU133953)。Gh CDPK1基因编码区全长1764 bp,编码587个氨基酸,分子量为65.5 k Da,理论等电点为5.46。该基因编码的蛋白是一个不稳定的亲水性蛋白,无跨膜结构域和信号肽,存在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶域和4个EF手型钙结合区,N端有豆蔻酰化位点和棕榈酰化位点,推测在膜上定位。同源比对发现,Gh CDPK1蛋白与雷蒙德氏棉、可可、毛果杨、脐橙、胡杨、蓖麻、麻疯树基因编码蛋白同源性高达84%以上,属于CDPKs基因家族;Sik CDPK1基因编码区全长1716 bp,编码571个氨基酸,分子量为63.5 k Da,理论等电点为5.44。该蛋白是一个不稳定的亲水性蛋白,无跨膜结构域和信号肽,存在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶域和2个EF手型结构,N端也存在豆蔻酰化位点和棕榈酰化位点。同源比对发现,Sik CDPK1蛋白与陆地棉、蓖麻、毛果杨、绒毛状烟草、芝麻、山葡萄基因编码蛋白同源性高达81%以上,属于CDPKs基因家族。2、构建p CAMBIA2300-35S-Gh CDPK1-GFP-OCS亚细胞定位载体,通过侵染洋葱表皮细胞,发现Gh CDPK1可能分布在细胞膜和细胞壁中。3、采用实时荧光定量PCR技术,分析了Gh CDPK1和Sik CDPK1基因在PEG6000、Na Cl和-4℃低温胁迫诱导下的表达模式。结果表明,Gh CDPK1和Sik CDPK1基因均能受干旱、高盐、低温的诱导表达,参与植物逆境信号胁迫应答。4、分别构建p CAMBIA2300-35S-Gh CDPK1-OCS和p CAMBIA2300-35S-Sik CDPK1-OCS植物过表达载体,并通过叶盘法转化烟草,利用RT-PCR方法鉴定阳性植株,获得转基因株系,进行干旱、高盐、低温胁迫,观察植株表型并对其相关生理指标进行测定。结果显示,转基因植株可以积累更多的渗透调节物质、增强抗氧化系统酶的活性和维持细胞膜的稳定性,在一定程度能降低逆境胁迫下植株的损伤,增强植物的抗逆性。