激光镊子拉曼光谱技术是将光镊与显微拉曼光谱技术相结合,可以俘获并长时间固定处于溶液中的单个细胞,可在接近自然的生理状态下研究掩盖在群体平均信息下的单个细胞的实时生化变化的信息。在微生物学分析研究领域具有低能量光束不伤害细胞、不需添加化学试剂、不需破坏细胞以及光学技术所具备的高效灵敏等优势。激光镊子拉曼光谱技术可反映微生物细胞内生物大分子的活动规律,实时跟踪微生物生化动力学过程,亦可有效地监测产物生成,为基础微生物学及发酵微生物学研究提供新兴技术。因此,本文结合激光镊子拉曼光谱技术的优势设计实验,为该技术的应用和发展提供更多的理论依据和重要参考。主要开展了以下实验工作：1.采用激光镊子拉曼光谱技术对圆红冬孢酵母合成油脂和类胡萝卜素进行定量分析,考察不同C/N、C/P以及C/S对圆红冬孢酵母在细胞水平油脂和类胡萝卜合成能力的影响。测定不同浓度植物油的拉曼光谱,其1751cm-1峰峰高与油脂浓度线性关系良好,相关系数R2可达0.97349,说明激光镊子拉曼光谱法是定量分析油脂的有效手段。以1751cm-1峰和1520cm-1峰峰高定量细胞内油脂和胡萝卜素含量,分析不同样品圆红冬孢酵母细胞的拉曼光谱,结果发现：随着C/N、C/P、C/S比升高,圆红冬孢酵母细胞内油脂含量逐步增加,而类胡萝卜素的含量则显著降低。以上结果说明,激光镊子拉曼光谱技术是实时检测圆红冬孢酵母细胞油脂及类胡萝卜素合成和优化发酵培养基的有效工具。2.红酵母是目前发现产类胡萝卜素的主要菌种,了解类胡萝卜素抗辐射的机制,探究红酵母生成的类胡萝卜素在其抗辐射过程中是否发挥作用,也有利于提高其产类胡萝卜素能力的研究。本实验分别取培养12、32、48、56、64、72、80h的红酵母为研究对象,此时它们色素含量差异较大,我们研究这不同时期红酵母抗辐射能力,考查类胡萝卜含量与红酵母抗辐射能力的相关性。平板计数结果反映出处于指数期细胞存活率较高,是稳定期的2倍,这可能是由于细胞在指数生长期活性强,生命力旺盛,不能体现出类胡萝卜素对红酵母抗辐射的保护作用。另外,可能类胡萝卜素存在于红酵母胞内,在其应对辐射等因素所诱导的活性氧损伤的防御体系中不能很好发挥作用。3.孢子是一种抗性很强的休眠体,可抵抗外界湿热、干燥等不利环境。但处于休眠状态的孢子一旦探测适宜其生存生长的条件,便会萌发生长成营养细胞,极端耐受能力随即消失。激光镊子拉曼光谱技术研究处于溶液中接近其生理状态的单个细胞或细胞器具有明显的优势,单细胞实时平均拉曼光谱可显示在孢子萌发过程中细胞内累积物质发生变化：萌发期内归属于DNA、蛋白质的722cm-1,1006cm-1峰的峰高基本不变,随后生长期上升明显,说明生长期胞内开始复制大量DNA,并合成蛋白质；归属脂类的1751cm-1峰的减弱趋势明显,可能是胞内脂类物质消耗造成的。整个萌发生长过程中,源自葡糖糖或海藻糖的858cm-1,908cm-1,1084cm-1,1118cm-1等峰强度先下降后上升,表明在适宜的生长条件下,海藻糖可能转化为单糖被细胞吸收利用,当营养物质逐渐被消耗掉时,细胞会再次累积海藻糖以抵抗外界条件。实验结果显示,利用激光镊子拉曼光谱技术可反映胞内生物大分子的活动规律,获知单个酵母孢子萌发过程中物质变化的丰富信息,此技术是探索单个活细胞实时生化变化的实用工具,为基础微生物学研究领域提供新的方法。