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萜类化合物是一类种类繁多且具有多种生物活性的化合物。萜类化合物的甲羟戊酸(MVA)途径及2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)生物合成途径中,由于MEP途径不存在于哺乳动物,而仅存在于绝大多数细菌(包括致病菌)中,因此该途径成为开发新型抗生素、抗疟疾药物及除草剂等有希望的靶标。其中1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)是MEP途径的第一个关键限速酶,催化丙酮酸与D-甘油醛-3-磷酸(D-GAP)生成1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP),随后DXP在1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)等一系列酶的作用下生成萜类化合物的前体物质异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。因此对DXS关键氨基酸残基的研究显得尤为重要。本课题着重研究了大肠杆菌DXS(EcDXS)的关键氨基酸残基。有研究者发现大肠杆菌DXS第420位及第478位精氨酸残基在活性位点附近形成一个阳离子口袋,用来容纳D-GAP的磷酸基团,而该磷酸基团在DXP形成后期起碳转移的作用。此外,还有研究者发现大肠杆菌DXS第49位组氨酸残基在TPP依赖酶中高度同源,且突变体EcDXS-H49Q丧失了其生物学活性。基于以上基础,我们使用定点突变技术获得10种突变体,其中包括5种基于EcDXS-H49Q基础上的双突变体,分别是EcDXS-H49QR420D、EcDXS-H49QR420P、EcDXS-H49QR420F、EcDXS-H49QR478D、EcDXS-H49QR478P,及 5 种单突变体,分别是 EcDXS-R420D、EcDXS-R420P、EcDXS-R420F、EcDXS-R478D、EcDXS-R478P。通过酶偶联法对这些突变体进行活性测定发现,5种双突变体及单突变体EcDXS-R420P均丧失其催化活性,而单突变体EcDXS-R420D、EcDXS-R420F、EcDXS-R478D、EcDXS-R478P则保留了部分活性,其活性分别为野生型EcDXS活性的8.70%、8.27%、18.10%、53.2%。深入分析表明,当把带正电荷的碱性氨基酸突变为带负电荷的酸性氨基酸或非极性且带苯环的氨基酸时,破坏了第420位与第478位氨基酸残基形成的阳离子口袋,使得D-GAP的磷酸基团不能与DXS紧密结合。但突变体EcDXS-R478P依然保留了50%的生物学活性,其原因可能在于第478位带正电荷的Arg突变为非极性Pro后虽与D-GAP的磷酸基团作用力变小,但也不像带负电荷的氨基酸残基与该磷酸基团那样相互排斥。因此,Ec-DXS-R478P依然保留部分活性。进一步,我们采用柱前衍生-HPLC方法对EcDXS的底物谱进行深入研究。使用Wt-EcDXS及10种EcDXS突变体分别催化D-GAP与丙酮酸、亚硝基苯与丙酮酸、苯甲醛与丙酮酸的反应。发现Wt-EcDXS及突变体EcDXS-R420D、EcDXS-R420F、EcDXS-R478D、EcDXS-R478P均可不同程度催化以上反应,进一步推测亚硝基苯、苯甲醛在与丙酮酸的反应过程中与酶的结合方式可能同D-GAP在某种程度上有一定的一致性。除此之外,我们还发现Wt-EcDXS及突变体EcDXS-R478D、EcDXS-R478P均可催化丙酮酸自身反应以及丙酮酸与2-丁酮酸的双底物反应,但均未检测到反应产物。进一步研究发现在催化丙酮酸自身反应的过程中DXS依然保留了依赖TPP的天然属性,但辅因子Mg2+对于该反应仅有较微弱的促进。相关研究仍在继续进行中。