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研究背景：在成年哺乳动物大脑内,神经元再生作用持续发生。其生发区主要位于侧脑室的脑室下区(subventricular zone, SVZ)和海马齿状回的颗粒下层(subgranular zone, SGZ)。新生细胞可迁移、分化为成熟神经元,并整合至已有神经环路中,参与调节认知功能。然而,神经元再生作用随着年龄的增长而显著降低,并伴随学习、记忆等功能下降,但是引起此现象的机制尚不清楚。Notch信号转导通路被认为是掌握细胞命运的重要通路,对胚胎发育期和成年动物大脑神经干细胞(neural stem cells, NSCs)的维持、增殖和分化具有关键作用。当Notch受体和相邻细胞上的配体结合后,释放Notch受体细胞内分子进入细胞核,调节转录。动物研究显示Notch信号转导通路可维持年轻成年小鼠脑SVZ和SGZ区NSCs的数量,而阻断Notch信号转导通路,则降低NSCs的维持和增殖。然而,Notch信号转导通路对生理状态下老年大脑内神经元再生的作用尚未见报道。脑缺血可诱导成年哺乳动物大脑SVZ和SGZ区NSCs的增殖,由此产生的新生细胞可迁移至脑缺血损伤区,分化为成熟神经元,从而补充受损神经元,并在一定程度上恢复受损的神经功能。然而,脑缺血引起的神经元再生的分子机制尚不清楚。动物研究显示Notch信号转导通路影响年轻成年动物脑缺血后神经元再生作用：脑缺血后,SVZ和SGZ区的Notch信号表达上调；激活Notch信号能减少脑缺血后NSCs的死亡,增加神经元再生作用,并改善缺血后受损的运动功能；而抑制Notch信号,则明显降低缺血诱导的NSCs增殖；并且SVZ区星形胶质细胞反应也和Notch信号转导通路激活相关。但是,Notch信号转导通路对老年动物脑缺血后神经元再生有何作用仍未见报道。研究目的：本课题拟观察Notch信号转导通路对正常及脑缺血损伤老年大鼠脑SVZ区的神经元再生的作用,做以下2个方面的研究：1.观察Notch信号转导通路在不同年龄大鼠脑SVZ区的表达,及其细胞表达类型,并通过调控Notch信号转导通路,观察其对正常老年大鼠脑SVZ区神经元再生的作用。2.观察Notch信号转导通路在脑缺血损伤后老年大鼠脑SVZ区的时间表达；并通过调控Notch信号转导通路,观察其对脑缺血后老年大鼠脑SVZ区神经元再生及行为学功能的影响。研究方法：以渗透压缓释微泵承载Notch信号激活剂及抑制剂,进行大脑侧脑室注射。以电凝法制备左侧远端大脑中动脉阻塞(distal middle cerebral artery occlusion, dMCAO),诱导大鼠永久性局灶性脑缺血模型。以免疫组织化学及免疫印迹方法,观察Notch信号转导通路在正常及脑缺血损伤老年大鼠脑SVZ区的表达特点,免疫荧光共染色观察Notch信号转导通路对神经元再生的作用及其细胞表达类型。以神经症状缺损评分、悬空旋转试验、转棒试验、圆筒试验、水平梯行走试验、肢体对称性试验等一系列行为学评分项目,观察Notch信号转导通路对脑缺血后老年大鼠的神经功能影响。研究结果：第一部分Notch信号转导通路在不同年龄大鼠脑SVZ区的表达,及其细胞表达类型,并通过调控Notch信号转导通路,观察其对正常老年大鼠脑SVZ区神经元再生的作用依据本实验室之前的研究方法,制备Notch信号转导通路激动剂及抑制剂,并用渗透压缓释微泵承载试剂,进行大脑侧脑室注射。Western blot实验结果显示,正常老年大鼠脑SVZ区的Notch受体Notch1、Notch4, Notch配体Jagged1、 Notch的细胞内分子(Notch intracellular domain, NICD)的蛋白表达皆明显低于年轻成年大鼠。与Western blot结果一致,免疫组织化学结果显示老年大鼠的Notch1、 Notch4、Jagged1和NICD阳性细胞数也明显少于年轻大鼠。免疫荧光共染色结果显示,正常老年大鼠脑SVZ区的Notch1、NICD和Hes1阳性细胞主要表达于神经元前体细胞(doublecortin,DCX-标记)；而Jagged1阳性细胞主要表达于星形胶质细胞中。而侧脑室注射Notch信号转导通路激动剂3d后,老年大鼠脑SVZ区的新生细胞(bromodeoxyuridie, BrdU-标记)、神经元前体细胞(DCX标记)及新生神经元前体细胞(BrdU-DCX共标记)数目比人工脑脊液注射对照组及Notch信号转导通路抑制剂组动物皆明显增加；而侧脑室注射Notch信号转导通路抑制剂3d后,老年大鼠脑SVZ区的BrdU、DCX及BrdU-DCX共染阳性细胞数比人工脑脊液注射对照组及Notch信号转导通路激活剂组动物皆明显减少。这些结果提示,Notch信号转导通路在大鼠脑SVZ区中的表达呈年龄相关性下降；Notch信号转导通路主要表达于神经元前体细胞中；Notch信号转导通路的激活能促进生理状态下老年大鼠脑SVZ区的神经元再生。第二部分Notch信号转导通路在脑缺血损伤后老年大鼠脑SVZ区的时间表达；并通过调控Notch信号转导通路,观察其对脑缺血后老年大鼠脑SVZ区神经元再生及行为学功能的影响Western blot实验结果表明,在脑缺血损伤后1d,老年大鼠脑SVZ区Notch1和NICD的蛋白表达明显增强。免疫荧光共染色结果显示,侧脑室注射Notch信号转导通路激动剂3d后,老年大鼠脑SVZ区BrdU、DCX及BrdU-DCX共染阳性细胞数比人工脑脊液注射对照组及Notch信号转导通路抑制剂组动物皆明显增加；而侧脑室注射Notch信号转导通路抑制剂3d后,老年大鼠脑SVZ区BrdU、DCX及BrdU-DCX共染阳性细胞数比人工脑脊液注射对照组及Notch信号转导通路激动剂组动物皆明显减少。行为学结果表明,在脑缺血术后1d、3d,侧脑室注射Notch信号转导通路激动剂组的老年大鼠,相对人工脑脊液对照组及Notch信号转导抑制剂组动物,受损的神经功能得到明显改善。这些结果提示,脑缺血后Notch信号转导通路的表达增加；Notch信号转导通路的激活,可促进老年大鼠脑SVZ区缺血诱导的神经元再生作用并改善脑缺血后受损的神经功能。研究结论：1. Notch信号转导通路在大鼠脑SVZ区中的表达呈年龄相关性下降；Notch信号转导通路主要表达于神经元前体细胞中；Notch信号转导通路的激活能促进生理状态下老年大鼠脑SVZ区的神经元再生。2.脑缺血后Notch信号转导通路在老年大鼠脑SVZ区表达增加；Notch信号转导通路的激活,可促进老年大鼠脑SVZ区缺血诱导的神经元再生作用并改善脑缺血后受损的神经功能。