在流行病学的研究报告中充分显示无机砷为人类致癌物,长期无机砷暴露除引发皮肤癌外也会有肺癌、膀胱癌、肝癌等癌症的发生。然而动物实验尚未直接证实砷化物的致癌性。为进一步了解无机砷的致癌性,并从人类皮肤角质形成细胞起源角度探索砷致皮肤癌发生的分子机制将为进一步理解砷致皮肤癌发生发展的机理提供新的证据,同时也为寻找对早期预防、早期诊断和治疗有价值的新的分子标记提供线索。由于皮肤是无机砷的主要靶组织,也是对砷毒性最敏感的组织之一,因此正常人皮肤角质形成细胞对于砷毒性作用的研究具有重要的实际意义。HaCaT永生化的人角质形成细胞株(以下简称HaCaT细胞)来源于正常人皮肤,与正常皮肤角质形成细胞分化特性相似,可无限传代,但无致瘤性,是体外研究砷致癌等作用机制的理想模型。因此本研究以HaCaT细胞为研究对象,采用存在于自然界中对人体毒性较大的三价无机砷：亚砷酸钠(sodium arsenite, NaAsO2)进行长期(30代,约4个月)、低浓度诱导其恶性转化。结果发现,NaAsO2处理HaCaT细胞至25代后(约100天),以皮下注射方式将细胞注射进入到裸鼠左腋下,可见肿瘤的形成,肿瘤组织切片观察判定是鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma, SCC),属于砷引起皮肤癌的一种类型。长期低水平砷暴露诱导成致瘤性的HaCaT细胞群中可能“存在的”为数不多的具有自我更新能力、分化潜能的癌干细胞(Cancer stem cells, CSCs),而CD44v6是其潜在的特异性分子标志物。肿瘤干细胞标志物CD44v6的活化可能与NaAsO2对NF-κ B的激活和对P53的抑制有关。采用基因芯片技术、荧光定量PCR技术分析NaAsO2处理导致致瘤性转化的HaCaT细胞和同期配对的对照组HaCaT细胞的基因表达谱变化,通过生物信息学分析发现细胞增殖、免疫系统反应、细胞生长、细胞粘附运动等生物过程的失调或改变在长期低浓度NaAsO2诱导HaCaT细胞致瘤性转化过程中发挥重要作用。差异基因参与多条与肿瘤及癌干细胞密切相关的信号通路,如Wnt、MAPK、NOTCH、p53、cell cycle、apotosis、Jak-STAT、 TGF-beta、NF-κB、PI-3K/AKT等信号通路。与这些生物过程、信号通路密切相关的基因可能是砷致HaCaT细胞恶性转化过程中的关键因子,如鼠类胸腺瘤病毒(v-akt)同源体2/β-rac蛋白激酶(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog2/protein kinase Bβ, AKT2),骨髓细胞瘤病毒同源的MYC原癌基因(v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog, MYC), MDM2癌基因(Mdm2p53binding protein homolog, murine double mimute2, MDM2),细胞周期蛋白D3(cyclin D3, CCND3),丝裂原活化蛋白激酶3K14(mitogen-activated protein kinase kinase kinase14, MAP3K14), Jak蛋白酪氨酸激酶-1(Janus kinase1, JAK1),基质金属蛋白酶-9(matrix metallopeptidase9, MMP9), PTEN抑癌基因(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN), ATM抑癌基因(Ataxia telangiectasia mutated, ATM),信号传导子及转录激活子5A(Signal transducer and activator of transcription5A, STAT5A), Rho相关蛋白激酶2(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase2, ROCK2)等。第一章长期低浓度砷剂诱引角质形成细胞恶性转化的研究为进一步了解无机砷的致癌性,因此利用0.05ppm(约0.4μM)NaAsO2处理人永生化角质形成细胞株(HaCaT)大约4个月,探讨暴露在长时间低浓度无机砷下的HaCaT细胞的生长情形,诱导HaCaT细胞发生致瘤性转化,为进一步探索、分析转化过程中肿瘤干细胞标志物表达变化和基因表达谱的变化提供基础。HaCaT细胞常规培养于完全培养基DMEM。长时间细胞培养的做法是接种5×105个HaCaT细胞于100ml培养瓶中并且分别处理0,0.05ppm NaAsO2,当满2天时更换新的DMEM培养液,满4天时则进行隔代培养。总共隔代培养30代,约4个月中NaAsO2持续存在于DMEM培养液中。细胞培养期间,倒置显微镜下观察每代细胞形态的变化并拍照。并进行软琼脂克隆形成率(Colony-forming efficiency, CFE)等实验验证细胞的转化、应用MTT法测定转化细胞的增殖能力、流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)检测转化细胞的细胞周期、并将恶性转化和同期配对传代的对照组HaCaT细胞注射于Balb/c裸鼠左侧腋窝皮下,观察肿瘤形成情况,并作组织切片、HE染色后进行组织病理学鉴定。NaAsO2处理HaCaT细胞至25代后(约100天),以皮下注射方式将细胞打入裸鼠左腋下,可见肿瘤的形成。并且借由观察肿瘤组织切片判定是鳞状细胞癌,是砷引起皮肤癌的一种类型。经长期低浓度无机砷刺激的HaCaT细胞发生了致瘤性转化。此外,HaCaT细胞还有下列几项的变化：(1)软琼脂克隆形成实验表明NaAs02长期低浓度处理的细胞具有了非停泊性依赖生长的特性。(2)光镜下观察到细胞于培养瓶内长满时有较高的细胞密度,出现排列紊乱、重叠交叉生长现象,并出现多核巨细胞。(3)MTT检测结果表明长期低浓度NaAs02处理的HaCaT细胞的增殖能力较对照组细胞明显增强。(4)NaAsO2处理的HaCaT细胞较未处理的细胞有更多的细胞处于细胞周期的S、G2/M期,说明受NaAsO2处理细胞的增殖能力旺盛。本部分实验成功建立了低水平NaAsO2慢性处理所致HaCaT细胞恶性转化模型,从而为进一步探讨砷化物所致细胞恶性转化分子机制提供了基础。第二章长期低浓度砷剂诱引角质形成细胞恶性转化过程中肿瘤干细胞标志物的表达及意义本部分旨在探讨肿瘤干细胞在砷致人角质形成细胞恶性转化中的作用及其影响因素,以期发现或揭示砷致皮肤癌过程中的肿瘤干细胞特异性标志物及相关信号转导通路。分别对第0,5,10,15,20,25,30代低浓度NaAsO2处理的HaCaT细胞和同期配对的对照组HaCaT细胞滴片进行荧光免疫组化(Immunofluorescence, IF)染色；同时提取上述不同时间点两组细胞的总蛋白,利用蛋白印迹(Western blotting, WB)等实验技术对可能存在的肿瘤干细胞标志物进行筛选,与其他检测指标进行相关分析。并分析其影响因素。结果显示,长期低浓度NaAsO2处理的HaCaT细胞中,肿瘤干细胞标志物CD44v6蛋白含量有逐渐增加的表现；对照组CD44v6蛋白含量未发现明显变化。恶性转化的HaCaT细胞(第25代)其CD44v6蛋白含量比同期对照组HaCaT细胞(第25代)显著增加(P<0.05)。NaAsO2处理组HaCaT细胞在15代后,CD44v6阳性表达显著增加,定位于细胞膜,在25代和30代约有8%的阳性率。对CD44v6的表达与软琼脂克隆阳性率之间的关系进行分析,结果发现,r=0.949,P=0.01,两者呈正相关性。肿瘤干细胞标志物CD44v6表达变化可能与砷致NF-κB激活、P53抑制有关。实验结果提示,长期低水平砷暴露所致皮肤损伤或癌组织中可能“存在的”为数不多的具有自我更新能力、分化潜能的癌干细胞,而CD44v6是其潜在的特异性分子标志物。肿瘤干细胞标志物CD44v6的活化可能与NaAsO2对NF-K B的激活和对P53的抑制有关。第三章长期低浓度砷剂诱引角质形成细胞恶性转化的基因表达变化本部分实验目的是探讨NaAsO2诱引人类皮肤细胞HaCaT恶性转化过程中基因表达谱的改变,分析差异基因的生物学意义,进而揭示在NaAsO2诱导HaCaT细胞致瘤性转化过程中可能起关键作用的生物学通路和分子,为理解砷暴露致皮肤癌发生的分子机制提供线索。实验方法：提取正常HaCaT细胞和转化HaCaT细胞的总RNA,应用高通量的基因芯片技术分析转化HaCaT细胞和正常对照HaCaT细胞基因表达谱的改变,运用实时定量PCR技术验证芯片的结果,并结合生物信息学分析对差异基因进行功能分类,同时探讨差异基因之间以及差异基因与其他基因之间可能的网络联系。结果发现,恶性转化的HaCaT细胞和正常对照HaCaT细胞共发现2,871个表达差异基因(P<0.05时,差异倍数≥2),约占芯片探针总数的6.1%(2,871/44,000)。其中1,415个基因表达上调,1,456个基因表达下调。其中表达上调的基因包括鼠类胸腺瘤病毒(v-akt)同源体2/β-rac蛋白激酶(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog2/protein kinase Bβ,AKT2),骨髓细胞瘤病毒同源的MYC原癌基因(v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog, MYC), MDM2癌基因(Mdm2p53binding protein homolog, murine double mimute2, MDM2),细胞周期蛋白D3(cyclin D3, CCND3),丝裂原活化蛋白激酶3K14(mitogen-activated protein kinase kinase kinase14, MAP3K14)等；表达下调的基因有Jak蛋白酪氨酸激酶-1(Janus kinase1, JAK1),基质金属蛋白酶-9(matrix metallopeptidase9, MMP9), PTEN抑癌基因(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN),ATM抑癌基因(Ataxia telangiectasia mutated, ATM),信号传导子及转录激活子5A(Signal transducer and activator of transcription5A,STAT5A), Rho相关蛋白激酶2(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase2, ROCK2)等。实时荧光定量PCR分析上述基因在两组细胞中的表达,进一步证实了芯片结果的可靠性。用Gene Ontology(GO)数据库将差异基因进行功能注释,结果发现差异基因产物主要参与细胞增殖(cell proliferation)、免疫系统反应(immune system process).细胞生长(cell development)、细胞粘附(cell adhesion)等与肿瘤发生、发展相关密切的功能调节。KEGG和Biocarta数据库分析差异基因之间的相互作用网络,结果发现差异基因参与多条信号通路,其中已知Wnt、MAPK、NOTCH、p53、cell cycle、apotosis、Jak-STAT、TGF-beta、 NF-κB、PI-3K/AKT等信号通路与肿瘤及癌干细胞密切相关。AKT2, JAK1, MMP9, MYC, PTEN, ATM, MDM2, STAT5A, CCND3, MAP3K14和ROCK2等与多条通路有关,可能在NaAsO2诱导HaCaT细胞的转化过程中发挥关键的作用。以上结果提示：长期低浓度NaAsO2处理直接引起HaCaT细胞基因表达改变,砷暴露导致的细胞增殖、免疫调节、细胞粘附运动失衡或改变在其诱导HaCaT细胞致瘤性转化过程中可能发挥重要作用,Wnt、MAPK等多条信号通路参与砷诱导HaCaT细胞致瘤性转化过程,AKT2, JAK1, MMP9, MYC, PTEN, ATM, MDM2, STAT5A, CCND3, MAP3K14和ROCK2等基因可能是这一过程中的关键分子。结论1.人永生化角质形成细胞株HaCaT在长期低水平NaAsO2作用下发生了致瘤性转化。2.长期低水平砷暴露诱导成致瘤性的HaCaT细胞群中可能“存在的”为数不多的具有自我更新能力、分化潜能的癌干细胞,而CD44v6是其潜在的特异性分子标志物。3.肿瘤干细胞标志物CD44v6的活化可能与NaAsO2对NF-κB的激活和对P53的抑制有关。4.分析了正常HaCaT细胞、转化HaCaT细胞的基因表达变化。在转化过程中发生改变的基因主要参与调节细胞增殖、免疫反应、细胞粘附运动等生物学过程；以及Wnt、MAPK、NOTCH、p53、cell cycle、apotosis、Jak-STAT、 TGF-beta、NF-kB、PI-3K/AKT等多条信号通路；AKT2, JAK1, MMP9, MYC, PTEN, ATM, MDM2, STAT5A, CCND3, MAP3K14和ROCK2等基因可能是转化过程中的关键分子。