论文部分内容阅读
目的：肾脏是随衰老发生明显结构和功能改变的重要器官之一。衰老肾脏主要组织病理学表现为：肾皮质变薄、肾小球硬化、肾间质纤维化、肾小管萎缩及肾血管硬化。其中肾间质改变被认为是导致衰老肾脏功能减退的主要原因，既往研究中发现衰老肾脏常伴随肾脏纤维化，但是两者之间的关系如何尚不清楚。上皮间充质转分化EMT是导致肾间质纤维化的重要机制，因此，本课题利用体内和体外肾脏衰老模型，拟探究肾脏衰老及间质纤维化的关系，以及衰老肾脏EMT发生的可能机制，这对延缓衰老肾脏损害及防治衰老相关肾脏疾病具有重要意义。方法：采用3月龄及24月龄F344雄性大鼠作为青年及老年大鼠模型，体内实验利用SA-β-gal染色、Masson染色检测胶原纤维以及组织免疫荧光染E-cadherin、α-SMA明确大鼠肾脏衰老、肾间质纤维化与EMT程度。体外实验提取人原代近端肾小管上皮细胞，用高糖（33mM）分别刺激0h、6h、12h、24h、48h、72h建立应激诱导肾小管上皮细胞衰老模型，通过Western blot检测衰老相关标志物p53、p21及EMT指标E-cadherin、vimentin、α-SMA的表达变化，以明确肾小管上皮细胞衰老及EMT的关系；利用细胞免疫荧光方法观察高糖刺激0h、24h、72h细胞E-cadherin、α-SMA的表达，动态观察EMT指标的变化；为明确衰老肾小管上皮细胞是否通过衰老相关分泌表型（SASP）机制、分泌细胞因子促进邻近细胞发生EMT；我们收集高糖刺激肾小管上皮细胞24h的细胞上清液（SEN-CM）培养正常细胞48h，以正常细胞上清液(CM)作为对照，Westernblot检测细胞EMT指标变化；利用siRNA干预p53抑制细胞衰老，收集高糖刺激24h后的细胞上清液SEN-CM(sip53)，培养正常细胞48h，分别以CM、SEN-CM、SEN-CM(si-con)作为对照，Western blot检测EMT指标表达变化，以证明抑制衰老后细胞是否发生EMT；为验证衰老细胞是否通过旁分泌TGF-β1诱导邻近细胞发生EMT，我们利用ELISA试剂盒检测CM、SEN-CM、SEN-CM（sip53）、SEN-CM(si-con)各组中的TGF-β1的含量，以验证我们的假设；进一步通过TβR1I抑制TGF-β1/SMAD通路，观察SMAD4、pSMAD3及EMT指标的表达变化，验证SEN-CM确实能通过TGF-β1/SMAD通路发挥促EMT作用。结果：相比3月龄大鼠，24月龄大鼠肾小管出现明显的SA-β-gal染色阳性，Masson染色示胶原纤维染色阳性、组织免疫荧光发现肾小管E-cadherin表达下降、α-SMA表达升高，表明老年大鼠肾小管发生衰老、肾小管上皮细胞发生EMT及肾间质纤维化。体外实验，提取并培养人原代近端肾小管上皮细胞，高糖（33mM）诱导24h后出现SA-β-gal染色阳性，Western blot显示衰老相关标志物p53及p21表达逐渐增加，证实高糖刺激24h后肾小管上皮细胞发生细胞衰老表型（p＜0.05）。Western blot显示高糖刺激48h后E-cadherin表达逐渐下降，vimentin及α-SMA表达逐渐上升，且细胞的免疫荧光显示，相比0h，高糖刺激72h E-caherin表达明显下降，α-SMA表达明显升高，说明高糖刺激48h后细胞出现EMT表型（p＜0.05）。因此，证实肾小管上皮细胞发生细胞衰老早于EMT。继而我们推测衰老细胞可能通过旁分泌SASP促进邻近细胞发生EMT，因此我们收集SEN-CM培养正常细胞48h，与CM组相比，SEN-CM组细胞E-cadherin表达下降，vimentin及α-SMA表达升高，说明衰老细胞确实能够通过旁分泌SASP促进邻近细胞发生EMT。为验证抑制衰老后是否能抑制SASP、减轻EMT的发生，我们利用siRNA技术抑制p53/p21衰老通路后发现，与SEN-CM组相比，SEN（sip53）组E-cadherin表达未见明显下降，vimentin，α-SMA表达未见明显增加，证实抑制肾小管上皮细胞衰老能减轻EMT发生。既往文献报道TGF-β1在肾小管上皮细胞EMT过程中起主要作用，为明确衰老细胞是否通过分泌TGF-β1促进邻近细胞EMT，通过ELISA检测CM、SEN-CM、SEN-CM（sip53）、SEN-CM（si-con）中的TGFβ1含量，发现与CM比较，SEN-CM的TGF-β1分泌增加，而SEN-CM（sip53） TGF-β1分泌增加不显著，证实衰老细胞通过旁分泌TGF-β1促进相邻细胞发生EMT，进而中和TGF-β1受体、抑制TGF-β1/SMAD通路后发现，相比SEN-CM组，本组细胞E-cadherin表达下降与vimentin、α-SMA表达增加均得到抑制，由此证实衰老肾小管上皮细胞能够通过分泌TGF-β1促进邻近肾小管上皮细胞发生EMT。结论：本研究利用体内及体外实验证实衰老肾脏的肾小管上皮细胞出现衰老表型及EMT。肾小管上皮细胞发生细胞衰老早于EMT，抑制细胞衰老也抑制EMT发生。衰老的肾小管上皮细胞通过SASP机制、旁分泌TGF-β1促进邻近细胞发生EMT。