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G-四链体-氯化血红素(Hemin)DNA酶是一种由特定的核酸G-四链体与Hemin结合后形成的具有过氧化物酶活性的人工模拟酶。目前这类DNA酶已经被用在了多种传感器的设计(包括适配体传感器、金属离子传感器、DNA传感器、酶传感器及药物传感器)。本论文利用G-四链体-Hemin DNA酶设计了两种传感器,一种是DNA传感器,它采用类似于聚合酶链式反应(PCR)的温度循环来扩增形成G-四链体-Hemin DNA酶,这种方法能有效地进行核酸的高度特异性检测,并能有效地进行单核苷酸多态性(SNP)的识别。另一种是Hg2+传感器,它是基于Hg2+参与形成裂分的G-四链体-Hemin DNA酶,从而设计出一种高灵敏度和高选择性的Hg2+检测方法。
在DNA检测方法中使用的寡核苷酸探针链主要由两部分组成,第一部分是5′-端的富G序列。5′-端的富G序列由于只含三组连续的GGG序列而无法满足G四链体的形成条件,从而不能形成G-四链体。第二部分是3′-端的引物序列。当靶基因存在时,3′-端的引物序列能特异性地与靶基因结合,并在Taq DNA聚合酶的作用下会沿靶基因链延伸。若处于引物结合位点下游的靶基因链上存在有连续的碱基Cn(n≥2)序列,引物会沿靶基因链延伸出相应数目的连续Gn(n≥2)序列,延长后的探针具有4个Gn重复序列,从而能够形成G-四链体,在Hemin的存在下能催化H2O2氧化ABTS(2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸))的反应。为了提高检测灵敏度,我们在检测过程中引入一个类似于PCR反应的温度循环,这一温度循环可对形成的G-四链体进行一定程度的线性放大,从而放大了G-四链体参与的催化反应信号,使靶基因的检测限达到0.2 nM。另外,该方法能很容易地检测到靶基因上单个碱基的改变,用该方法进行SNP检测,其检测结果可用裸眼进行判断。
在Hg2+检测方法中,用到两条无标记的寡核苷酸链。在Hg2+存在的情况下,两条寡核苷酸链相互杂交形成一条双链,双链中的T-Hg2+-T键的形成稳定了T-T错配。此时,两条链上的富G序列形成一个裂分的G-四链体,G-四链体与Hemin结合形成具有高度催化活性的G-四链体-Hemin DNA酶。使用简单的比色技术,这种“turn-on”方式(信号随Hg2+的增大而增强)可检测溶液中低至19nM的Hg2+。