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手足口病(Hand，foot，and mouth disease HFMD)是一种儿童流行性传染病，主要表现为手、足和口腔粘膜的疱疹。手足口病疫情近年在亚太地区呈上升趋势，其病原为多种肠道病毒，包括肠道病毒71型，柯萨奇病毒A组（2，4，5，6，9，10，16型）、柯萨奇病毒B组（2，5型）以及埃可病毒等。通常情况下，各种肠道病毒感染引起的HFMD在体征和临床症状方面难以区别，但由于EV71感染引起的HFMD容易导致心肌炎、脑干脑炎、无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎样麻痹等多种严重并发症，有较高的病死率及致残率，所以早期特异性检测和确诊HFMD为何种肠道病毒感染对临床治疗有重要意义。 2012年8-12月，江西九江爆发手足口病，本实验室共收集到704份（每人一份）手足口病咽拭子标本和200份病人血清，通过RT-PCR检测咽拭子标本，证实为柯萨奇病毒A6型(Coxsackievirus A6，CVA6)感染，确认这次爆发为CVA6所致。2012年以后我国CVA6引起的手足口病不断增多，已逐渐成为引起手足口病爆发的主要病原之一。 CVA6为单股正链小RNA病毒科（Picornaviridae）、肠道病毒属(Enterovirus)成员。与其他柯萨奇病毒一样，CVA6病毒颗粒为二十面体立体对称球形，无包膜和突起。其编码的多聚蛋白经自身蛋白酶水解为P1、P2和P3三种前体蛋白。P1区编码病毒的结构蛋白VP1～4，组成病毒衣壳。以往研究认为，VP1蛋白是小RNA病毒主要的中和决定因子，是特异性中和表位的所在区域，直接决定病毒的抗原性。因此，VP1蛋白也是小RNA病毒疫苗和诊断试剂研制的主要对象。 本论文对CVA6主要结构蛋白VP1的表位鉴定以及抗原特性进行研究，旨在为CVA6的疫苗研制和血清学诊断试剂的开发提供科学依据。研究结果主要分为以下两个部分: 一、CVA6结构蛋白VP1的大肠杆菌表达、单克隆抗体的制备及抗原特性分析 为了研究CVA6结构蛋白VP1的抗原特性，我们采用大肠杆菌原核表达系统表达CVA6 VP1重组蛋白，蛋白纯化后，以VP1重组蛋白作为抗原，通过间接ELISA法分析与抗CVA6血清的反应性及与CVA16、EV71血清的交叉反应性，评价其免疫反应性。利用VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备了一系列单克隆抗体。通过间接ELISA检测单抗与CVA6、EV71和CVA16的VP1蛋白的免疫反应性。结果如下: A.利用基因重组技术成功构建了含CVA6 VP1全长基因的pET28a重组质粒，并在大肠杆菌中能高效表达CVA6 VP1重组蛋白，重组蛋白主要以包涵体形式表达，根据表达蛋白所携带的蛋白标签，利用镍离子金属螯合亲和层析技术获得纯化蛋白。 B.CVA6 VP1重组蛋白具有良好的免疫反应性，能与CVA6病毒免疫的小鼠血清呈现良好的反应性，但与EV71、CVA16血清之间有显著的交叉反应。 C.利用CVA6 VP1重组蛋白免疫小鼠，制备了4株单克隆抗体，利用间接ELISA法分析显示，4株单抗均可与CVA6 VP1蛋白反应，其中一株单抗(6C1)可同时与EV71VP1重组蛋白和CVA16 VP1反应，两株单抗(5A8，4A3)不与EV71 VP1反应，但与CVA16VP1反应，一株单抗(7B2)为抗His标签的单抗。 二、CAV6结构蛋白的抗原表位的定位与分析 为进一步研究CVA6 VP1蛋白的抗原表位的定位，我们采用重组抗原Mapping策略，表达了一系列长度不同、大小不等的重组肽段。以各VP1截短蛋白作为抗原，通过间接ELISA法分析与所制备的CAV6 VP1单克隆抗体的免疫反应性，评价其免疫反应性和特异性，结果如下: A.利用基因重组技术成功表达了一系列截短的CVA6 VP1重组蛋白，分别为:CVA6-VP11-305、 CVA6-VP110-305、CVA6-VP162-305、 CVA6-VP187-305、CVA6-VP1115-305、CVA6-VP1145-305。均以包涵体形式表达。 B.可以识别CVA6、EV71和CVA16 VP1重组蛋白的单克隆抗体6C1，可以被CVA6 VP1截短蛋白CVA6-VP11-305、 CVA6-VP110-305识别，但不与CVA6-VP162-305、 CVA6-VP187-305、CVA6-VP1115-305、 CVA6-VP1145-305反应，说明CVA6 VP1蛋白N端10-62aa区段含有肠道病毒(EV71、CVA6和CVA16)共同性表位。 C.可以识别CVA16 VP1重组蛋白，但不识别EV71VP1重组蛋白的两株单克隆抗体5A8、4A3，可以被CVA6 VP1截短蛋白CVA6-VP11-305、 CVA6-VP110-305、CVA6-VP162-305反应，但不与CVA6-VP187-305、CVA6-VP1115-305、 CVA6-VP1145-305反应，说明，CVA6 VP1蛋白N端62-87aa区段含有柯萨奇病毒（CVA6和CVA16）的共同性表位。 D.综上所述，我们的研究结果表明: (1) CVA6结构蛋白VP1及其截短蛋白片段在大肠杆菌中以包涵体形式表达; (2) CVA6结构蛋白VP1有很强的免疫反应性，但与EV71、CVA16的抗血清有显著的交叉反应性，所以不宜作为诊断抗原进行CVA6血清学的特异性检测; (3) CVA6 VP1蛋白N端10-62aa区段含有肠道病毒CVA6、EV71和CVA16的共同性表位。 (4) CVA6 VP1蛋白N端62-87aa区段含有柯萨奇病毒CVA6和CVA16的共同性表位。 遗憾的是，我们并没有制备出可以特异性识别CVA6而不识别EV71以及CVA16的单抗，所以没有办法进一步定位具有特异性抗原表位的位置，只能留给以后再继续研究。上述研究结果丰富了我们对CVA6的认识，将对未来基于CVA6-VP1的研究工作提供帮助。