骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)是一种常见的恶性骨肿瘤,在儿童和年轻成年人中发病率最高,其侵袭性强、预后差,占原发性骨肿瘤的60%。目前用于OS治疗的化疗药物主要有阿霉素、顺铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺、姜黄素等,但是在肿瘤的治疗过程中,单一药物化疗效果均不理想,药物毒副作用大,且容易产生多药耐药,影响患者预后。因此,肿瘤化疗方案中提倡多种药物联合治疗,选择不同作用机制、毒副作用不重叠的药物,起到协同抗肿瘤作用,以最低有效剂量,达到高疗效、少抗药性、轻毒副作用的目的。纳米粒载药系统因能够增加药物的溶解度,延长药物血液循环的时间；改善药物的药代动力学和药效学特性,促进药物在细胞内的传递,提高药物对肿瘤组织的靶向性；实现药物在肿瘤部位的被动或主动靶向以及生理环境敏感的药物释放,显著降低药物毒副作用等优点近年来备受关注,被认为是搭载抗癌药的最适宜剂型。阿霉素(DOX)是一种蒽环类药物,具有光谱抗肿瘤活性,用于治疗骨肉瘤、肝癌、胃癌、淋巴癌等恶性肿瘤。有研究证实DOX与其他药物联合应用能够显著提升肿瘤的治疗效果。但DOX具有一定的心脏毒性,影响肝肾功能,并能产生骨髓抑制等毒副作用。姜黄素(CUR)是从中国传统中药姜黄中提取的一种天然活性物质,其分子中含有二酮结构,是一种黄色多酚类色素。近年来的研究表明CUR有多种药理作用,对骨肉瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等癌细胞有促进凋亡的作用。CUR为从植物中提取的天然色素,其毒副作用小,对人体没有损伤,可作为一种有潜力的高效低毒抗肿瘤药物应用于临床。但CUR水溶性低,致使其口服生物利用度低,在体内难以达到有效血药浓度,限制了其应用。另外其半衰期短,在体内代谢和清除速率快,也制约了其临床应用。实验目的：本项研究中,为了克服DOX的多药耐药及严重不良反应,同时提高姜黄素的溶解度和生物利用度、延长其半衰期,将药物联合治疗和脂质纳米粒相结合,设计并制备了阿霉素-姜黄素共载药脂质聚合物纳米粒(DOX+CUR LPNs),通过体内外及荷瘤小鼠动物实验确定其对骨肉瘤的治疗效果。实验方法：1、阿霉素-姜黄素共载药脂质聚合物纳米粒的制备及表征研究(1) LPNs的制备：利用TEA、DMSO将DOX溶解制备基质；利用PLGA、二氯甲烷将CUR、DOX溶解制备油相；利用水将DLPC、胆固醇、PEG2k-DSPE溶解制备水相。将油相缓慢加入水相中混合,利用改良溶剂萃取法制备载药纳米粒。(2)利用透射电子显微镜(TEM)观察所制备的纳米粒形态；利用光子相关光谱法(PCS)测量LPNs粒径、多分散指数及Zeta电位。通过紫外-可见分光光度法测定LPNs中药物包封率(DEE)及载药量(DLC),其中测定DOX的波长为485 nm,测定CUR的波长为430 nm。(3)测定了LPNs的稳定性。将LPNs重悬于生理盐水中,在4℃条件下搅拌孵育,分别在第1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35天取样测定各组纳米粒粒径大小。在血清中的稳定性用含10%胎牛血清(FBS)的PBS溶液进行,37℃孵育12 h,分别在第0、2、4、8、12h取样,测定LPNs粒径大小。(4) LPNs的体外释药性采用透析法进行。将LPNs混悬液放入透析袋,将透析袋放入50 mL释放介质(含0.1%Tween-80的PBS缓冲液,pH 7.4)中,37℃恒温水浴震荡,分别在第0、2、4、6、12、24、48、72、96 h取样,每次取样结束后置换50 mL新的释放介质,通过紫外-可见分光光度法测定溶液中药物含量。2、阿霉素-姜黄素共载药脂质聚合物纳米粒抗肿瘤活性研究(1) LPNs的体外抗肿瘤作用评价利用MTT法进行。将5*103个KHOS细胞接种于96孔板37℃培养24 h,加入药物使每孔中药物浓度分别为0.5、1.0、5.0、10、50 p,M,37℃继续培养24 h,加入MTT溶液,3h后加入DMSO显色,570 nm测吸光值。根据吸光值计算药物抑制细胞增殖活性IC50。(2)药物体内组织分布采用5-6周龄BALB/c裸鼠进行,每只小鼠皮下注射1*106个KHOS细胞,一周后尾静脉注射药物。药物注射后15min、1h、2h、8 h、24 h、48 h、120 h时,每组分别处死两只小鼠,剥取肿瘤、心、肝、脾、肺、肾,迅速称重并分别用生理盐水匀浆处理,利用紫外-可见分光光度法测定不同组织中DOX和CUR药物含量。(3)LPNs的体内抗肿瘤活性利用5-6周龄BALB/c小鼠进行,小鼠随机分为8组,分别为DOX+CUR LPNs组、DOX LPNs组、CUR LPNs组、LPNs组、DOX+CUR溶液组、DOX溶液组、CUR溶液组、空白对照组。每组小鼠皮下注射1*106个KHOS细胞,一周后开始给药,采用尾静脉注射给药,每3天给药一次,每次给药前测定小鼠体重及肿瘤大小,连续给药3周。给药结束后颈椎脱位法处死小鼠,剥取肿瘤,称重并测量大小,计算肿瘤生长抑制指数(TGI)。实验结果：1、阿霉素-姜黄素共载药脂质聚合物纳米粒的制备及表征研究(1)通过改良溶剂萃取/蒸发法制备了共载药DOX+CUR脂质聚合物纳米粒(DOX+CUR LPNs)、单独载药DOX的脂质聚合物纳米粒(DOX LPNs)、单独载药CUR的脂质聚合物纳米粒(CUR LPNs)、及不载药脂质聚合物纳米粒(LPNs)。透射电镜下观察制备的纳米粒呈规整的球形,粒径大小在100 nm左右,粒径大小较均一,PDI为0.17-0.21,分散度适中,Zeta电位绝对值大于30 mV,分散体系稳定。(2)通过紫外-可见分光光度法测定DOX的药物包封率约为85%,CUR的药物包封率约为80%,且单独载药与DOX+CUR共载药体系两种药物的包封率相差不大。DOX与CUR单独载药的LPNs载药量分别为13.2、10.6,DOX+CUR共载药LPNs两种药物的载药量分别为9.1、8.3,略低于单独载药时的载药量。(3)初步考察了LPNs的稳定性,在生理盐水中35天纳米粒粒径大小没有显著变化,在血清中12h粒径大小没有显著变化,说明制备的LPNs性能稳定。(4)通过透析法测定了LPNs的体外释药特性,结果显示LPNs扣药物DOX和CUR可以在体外持续缓慢释放长达48 h。2、阿霉素-姜黄素共载药脂质聚合物纳米粒抗肿瘤活性研究(1)利用MTT法测定不同药物对肿瘤细胞的细胞毒性及细胞存活率。结果表明相同药物浓度下,包覆两种药物的DOX+CUR LPNs对肿瘤KHOS细胞的杀伤作用大于包覆单种药物的纳米粒制剂(P<0.05)。载药纳米粒制剂对肿瘤KHOS细胞的杀伤作用大于药物溶液(P<0.05)。纳米粒制剂和药物溶液中随着药物浓度的增加,对KHOS肿瘤细胞的细胞毒性均越大。2)以抑制细胞增殖活性IC50为参数,测定不同药物制剂的IC50值。DOX+CUR LPNs组抑制细胞增殖活性的IC50值最低,为0.6 μM；包覆两种药物的纳米粒制剂IC50值优于包覆单种药物的纳米粒。同样,载药纳米粒制剂IC50值优于游离药物溶液。3)测定了体内药物分布情况。结果显示DOX+CUR药物溶液中DOX和CUR主要分布于心脏和肾脏；而DOX+CUR LPNs中DOX和CUR主要作用于肿瘤部位,药物在肿瘤组织中的浓度明显高于其他组织。表明纳米粒制剂能有效的提高药物的靶向性,减少药物对人体正常组织器官的损害。4)研究了不同药物制剂的体内抗肿瘤作用。结果表明最明显的肿瘤消退发生在DOX+CUR LPNs一组,肿瘤生长被显著延迟,实验结束时该组小鼠肿瘤体积仅为182 mm2,而空白对照组(注射生理盐水)小鼠体内肿瘤大小为973 mm2。结果显示DOX+CUR LPNs治疗的骨肉瘤小鼠肿瘤生长抑制指数最高,为81.3%,明显高于其他给药组。另外空白对照组小鼠还观察到食物摄入量减少、精神萎靡不振、活动量减少,而在其他给药组小鼠中都没有观察到这种现象。结论：阿霉素-姜黄素共载药脂质-聚合物纳米粒(DOX+CUR LPNs)具有良好的抗骨肉瘤作用,克服了单种药物治疗带来的药物毒副作用,同时可以靶向肿瘤部位,增加药物在肿瘤部位的作用时间,对肿瘤起到良好的抑制作用。阿霉素-姜黄素共载药脂质聚合物纳米粒(DOX+CUR LPNs)将成为一种协同治疗OS的创新策略。