[背景]心肌梗死是严重威胁人类健康的疾病。我国每年约有2.9亿人罹患心血管疾病,并有350万人因此而丧生。心血管疾病死亡率位居我国城乡居民总死亡原因的首位,且呈逐年攀升趋势。目前心肌梗死的主要治疗手段还是药物和手术,虽然它们能够促进血管再通,减轻心肌的持续性损伤,但二者对梗死的心肌组织并无再生作用,且不能有效逆转心肌梗死后的纤维化。干细胞移植是一种新兴的治疗方法,其目的是促进缺血区心肌和血管生成,减少心肌细胞凋亡,减轻心室重塑。脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells,ASC)以其独特的优势,逐渐成为当前研究的热点。虽然ASC的安全性和有效性已得到初步认识,但其在体内的存活和显效还受到多个环节的影响。为了提高干细胞在局部的存活效率,研究者们开始对干细胞进行体外预处理或者对组织微环境进行改善,以利于细胞的长期存活和发挥修复功能。低氧预处理(Hypoxia precondition,HP)是增加干细胞存活率的简单有效的方法。为了适应移植后在梗死区局部的低氧环境,在体外对ASC进行低氧培养,以此增强细胞对低氧的耐受性和抗凋亡能力,同时促进其分泌多种生长因子,有利于细胞进入体内后发挥修复和再生功能。脐血单核细胞(Cord blood mononuclear cells,CBMNCs)能够促进血管新生和血管内皮化,改善梗死局部的微循环。内皮细胞的再血管化可以为移植的干细胞带来营养和氧气,有利于干细胞在局部的存活。因此,将体外预处理与体内微环境的改善结合起来,可能更有利于细胞在局部的长期存活。[目的]1.研究ASC的培养,鉴定和体外诱导分化能力；以及CBMNCs分离和冻存备用；2.检测低氧预处理前后ASC的基因表达变化；并体外模拟心梗环境培养HP-ASC和ASC,比较二者基因表达水平的变化；3.评价HP-ASC治疗大鼠心肌梗死是否优于ASC；4.评价HP-ASC联合CBMNCs治疗大鼠心肌梗死是否优于单一细胞移植效果。[方法]1.以健康成人脂肪抽吸术后的脂肪组织为实验对象,用胶原酶消化分解后,离心取下层SVF细胞,接种培养。用MTT法测量细胞密度并绘制ASC生长曲线；流式细胞术检测ASC细胞表面标记；分别以成骨、成脂、成软骨诱导液诱导ASC分化,利用组织化学染色和免疫蛆化染色检测其多向分化潜能。来自健康婴儿的脐血离心沉降法分离出CBMNCs,检测细胞数量及活性细胞比例,冻存备用。2.ASC在低氧(2%O2)条件下培养24h,提取细胞RNA,比较HP-ASC与未处理ASC基因表达情况；模拟体内心梗局部微环境,取大鼠心梗后3d的心脏组织,研磨成浆,加入血清及必须氨基酸等配制成心梗混合液。将HP-ASC和ASC在此混合液中培养5d,检测细胞在微环境诱导下基因表达的变化；3.两月龄Wistar雌性大鼠30只,按照随机数法将实验动物随机分为3组,HP-ASC组,ASC组和PBS组,每组各10只大鼠。结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死损伤模型,动物心梗后即刻心肌内注射干细胞(总量：2×106)或PBS。细胞移植后7d和15d每组分别处死5只大鼠,收集心脏组织,制作冰冻组织切片和石蜡组织切片。比较各组之间心梗部位的大体形态学变化,心梗区占左心室比例,细胞移植效率,细胞凋亡数量和新生血管密度。4. 两月龄Wistar雌性大鼠60只,按照随机数法将实验动物随机分为4组,HP-ASC组,HP-ASC+CBMNCs组,CBMNCs组和PBS组,每组各15只大鼠。模型成功后即刻进行细胞移植,细胞总量为2×106(联合组细胞比例1：1)。每组动物分别在手术后7d,15d和30d各取5只处死。比较各组之间心梗部位的大体形态学变化,心梗区占左心室比例和室壁厚度,细胞移植存活率和新生血管密度。[结果]1.原代ASC接种6h后,部分细胞开始贴壁生长,24-48h后细胞开始出现集落样增长(CFU)。第3代以后,细胞呈典型纤维母细胞样梭形外观,开始呈漩涡状生长,MTT法检测显示,ASC的对数生长期为3-7d,第8d开始进入平台期。流式细胞术检测结果表明,ASC细胞表达CD34(-)/CD45(-)/CD90(+)/CD105(+) /CD73(+)/CD44(+),符合间充质干细胞表型。诱导分化试验表明,ASC可以向成脂、成骨和成软骨方向分化。CBMNCs分离后,单核细胞数量达到8.9×109,活性细胞计数结果显示,活性细胞数占所有有核细胞的93.16%。2. 与ASC相比,HP-ASC表达多种生长因子及其受体水平增高,与干细胞特性相关的基因Klf4和Oct4略有增高,而Nanog和Sox2表达却较后者有所降低。此外,HP-ASC中与低氧诱导表达相关的基因--血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)和基质细胞衍生因子-1(Stromal cell derived factor-1,SDF-1)均表达增高,分别为ASC组的1.38倍和1.98倍。与细胞迁移和植入相关的基因,除金属蛋白酶组织抑制剂(Tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP-1)下降外,趋化因子受体-4(CXCR4),细胞间粘附分子(Intercellular cell adhesion molecule, ICAM-1和ICAM-2)的表达都有所增加。体外模拟心梗环境培养可以促进HP-ASC-T表达心肌特异性标志物(CX43, FABP4, GATA-4)和促血管生长因子(VEGF),同时也可促进HP-ASC-T表达多种生长因子及其受体。3. 动物试验表明,与PBS组相比,HP-ASC组和ASC组在心梗后7d及15d均可显著减少心梗面积,增加细胞存活数量,减少凋亡细胞数量,以及显著增加新生血管数量。而HP-ASC组较ASC组改善更为明显。4.心梗大鼠进行细胞移植后30天,HP-ASC组,HP-ASC+CBMNCs组和CBMNCs组均比PBS组明显改善了心功能。其中,HP-ASC组改善效果更好。组织学检测表明,HP-ASC组的心梗比例和心梗室壁厚度,细胞存活数量和新生血管数量均比其他对照组改善更好。[结论]1.本实验所培养ASC细胞表达CD34 (-)/CD45 (-)/CD90 (+)/CD105 (+)/CD73 (+)/CD44 (+),符合间充质干细胞表型。ASC有多向分化潜能,经体外诱导可向成骨、成脂、成软骨方向分化。离心沉降法可获得临床级数量的CBMNCs,分离后细胞存活率高。2.低氧预处理后,HP-ASC表达多种生长因子及其受体升高。模拟体内心梗局部微环境可使HP-ASC表达心肌特异性标志物、促血管生成因子和生长因子水平升高。3. 与ASC相比,HP-ASC可以更有效地减少大鼠的心梗面积,增加细胞存活比例,减少心梗区细胞凋亡数量,增加新生血管数量。4. HP-ASC对心梗大鼠心功能的改善效果比HP-ASC+CBMNCs组和CBMNCs组更好,其心梗比例和心梗室壁厚度,细胞存活数量和新生血管数量均比其他对照组改善更好。