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目的:利用酿酒酵母来源的β-葡聚糖——WGP(wholeβ-glucanparticles)结合树突状细胞(dendritic cells,DCs)表面Dectin(DC-associated C-type lectin)-1受体,检测相关胞内信号分子的改变,并观察DC表面糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关配体(glucocorticoid-induced TNFR-related protein ligand,GITRL)的表达情况；利用小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,观察WGP对肿瘤生长的影响,并研究WGP调节荷瘤小鼠抗瘤免疫应答的新机制。
方法:
1.通过GM-CSF和IL-4培养体系,体外诱导小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC),采用流式细胞术(FCM)检测其纯度。
2.通过PCR和流式细胞术检测D2SC／1细胞系以及BMDC细胞Dectin-1的表达情况。
3.体外采用WGP刺激D2SC／1细胞系和BMDC,通过Western-blot方法检测Dectin-1下游信号分子的活化情况；利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和流式细胞术检测细胞mGITRL的表达情况。
4.体外将WGP刺激后的D2SC／1细胞或BMDC与调节性T细胞(Treg)抑制体系或单独的效应性T细胞(Teff)共培养,采用[3H]TdR掺入试验检测WGP刺激后的DC对Treg的抑制功能和对效应性T细胞增殖的影响。
5.利用小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,观察经WGP处理后肿瘤的发展进程,采用流式细胞术和qRT-PCR检测小鼠体内DC细胞mGITRL的表达、CD3+CD8+IFNγ+T细胞及CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的变化情况。并通过GITR蛋白阻断WGP处理后荷瘤小鼠表达上调的mGITRL,观察肿瘤的生长、CD3+CD8+IFNγ+T细胞及CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的变化情况。
结果:
1.体外成功诱导和培养BMDC,经检测其纯度>90％。
2.经PCR和流式细胞术检测发现D2SC／1细胞系以及BMDC细胞均有Dectin-1受体的表达。
3.通过Western-blot检测,发现经WGP刺激后D2SC／1细胞和BMDC细胞Dectin-1下游信号分子Syk磷酸化水平明显升高；qRT-PCR和流式细胞术结果均显示:经WGP刺激后D2SC／1细胞和BMDC细胞mGITRL的表达均上调,并具有浓度依赖性。
4.体外增殖试验及Treg细胞免疫抑制功能试验表明,WGP刺激DC后表面上调的mGITRL能够通过GITR／GITRL系统促进效应性T细胞增殖,下调Treg细胞的抑制功能。
5.WGP能够有效地延缓Lewis肺癌移植瘤小鼠体内肿瘤的发展进程,抑制肿瘤的生长。FCM及qRT-PCR检测结果显示,经WGP处理后,其局部引流淋巴结、肿瘤组织中DC的比例、数目及其mGITRL的表达明显增加；脾脏、局部引流淋巴结、肿瘤组织浸润的CD3+CD8+IFNγ+T细胞的比例和数目明显上升；肿瘤组织浸润的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例明显下降,而脾脏、局部引流淋巴结中的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比例和数目与对照组相比并无明显变化,但是其免疫抑制功能明显下调。
为了阻断WGP处理组荷瘤小鼠体内表达上调的GITRL,我们体内给予可溶性GITR蛋白。与单独WGP处理的荷瘤小鼠相比,WGP+GITR组荷瘤小鼠体内肿瘤生长明显加快,肿瘤大小及重量明显增加；脾脏、局部引流淋巴结的CD3+CD8+IFNγ+T细胞的比例和数目明显下降,而肿瘤局部浸润的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例明显上升。
结论:
1.体外实验发现WGP可通过Dectin-1／Syk途径活化DC,上调DC表面mGITRL的表达,且上调的mGITRL能够促进效应性T细胞的增殖,同时下调Treg细胞的免疫抑制功能。
2.WGP能够明显延缓肿瘤的发展进程。其主要机制是通过上调DC表面mGITRL的表达,从而促进CD3+CD8+IFNγ+T细胞的产生,抑制调节性T细胞的产生及功能,以抑制肿瘤的生长。