伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)归属于α疱疹病毒亚科，主要引起猪的伪狂犬病(PR)，该病以仔猪的神经学症状和妊娠母猪的生殖障碍为主要特征。目前世界上包括我国在内广泛使用的预防此病的疫苗均带有gE基因缺失的表型特征。猪流感(SI)是由A型流感病毒引起的猪的呼吸道疾病或疾病综合征，临床以仔猪的严重呼吸道疾病、妊娠母猪的流产和部分成年猪的死亡为主要特征。此外，猪是禽和人流感病毒均可感染的唯一动物，是不同来源流感病毒发生重组，产生新的流感毒株的中间宿主。因此，通过免疫接种预防猪流感对食品安全和公共卫生具有重要意义。本试验的目的是以gE基因缺失的PRV为载体构建可以表达SIV HA基因的重组病毒疫苗用于预防这两种病，同时，基于此重组病毒的特点，建立可以区分此重组病毒疫苗和PRV及SIV自然感染的鉴别诊断方法。 本研究首先对SIV A/Swine/Inner mogolian/547/2001(H3N2)毒株(简写SWNM547)的HA基因进行了RT-PCR扩增与测序，结果表明HA基因包含完整的开放阅读框，全长1701bp，编码566个氨基酸残基。通过与其它7株国内SIV分离株和6株GeneBank中的H3流感病毒HA序列比较分析，结果表明分离自我国不同地区的8株H3 SIV核苷酸序列同源性均在95%以上，且与禽流感病毒(AIV)经典代表株DKUK-63序列同源性在95-100%之间，证实我国H3 SIV HA基因来源于禽的流感病毒。虽然基于HA的疫苗不能提供不同亚型病毒的交叉保护，但对于同一亚型的病毒却有着良好的免疫保护力。 克隆伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株基因组中的KpnⅠ J片段，然后亚克隆其中的KpnⅠ-PstⅠ片段，缺失重组质粒中的EcoRⅠ位点和NotⅠ-HindⅢ片段；再用AccⅠ切去378bp，在此缺失位置插入来源于pCR3-Uni的CMV启动子、多克隆位点和BGH polyA信号，构建了PRV转移载体pBdTK-Uni。在此基础上，进一步用TthlllⅠ酶切后，补平插入带有SV40启动子的大肠杆菌β—半乳糖苷酶报一告基因(LacZ)，获得通用转移载体pLTK-Uni。然后定向亚克隆SWHA基因于多克隆位点，获得重组转移载体pLTK-HA。利用脂质体介导的方法，将pLTK-HA与PRVBartha-k61基因组共转染于亚单层Vero细胞，依据报告基因LacZ在细胞中的表达，筛选蓝色蚀斑的重组病毒，经数次蚀斑纯化后，PCR鉴定、Western-blot分析。结果表明所获得的重组病毒（rPRVHA）遗传性状稳定，在培养细胞中能稳定的表达与 SIV HA具有相似生物学活性的外源蛋白，为进一步制备抗猪流感的重组伪狂犬病毒活载体疫苗奠定了基础。 为了区分此重组病毒疫苗免疫的动物和自然感染PRV和SIV的动物，本项研究利用基因工程抗原建立了两种分子鉴别诊断方法。 虽然A型流感病毒变异频繁，但其核蛋白（NP）是其保守性蛋白，具有种群和型的特异性。本试验经 RTPm扩增 T A／S一eilon③iangi3厘000（H3NZ）株 SW的NP基因。酶切鉴定后亚克隆NP基因于原核表达载体pET30（a中获得重组质粒pETNP。SDS－PAGE、WestC：ttkblot分析表明表达的NP具有良好的抗原反应活性。利用重组的 NP蛋白进一步建立了猪流感琼脂扩散试验（AGrp）诊断方法，对其它8种猪病原阳性血清和 40份送检血清样品进行 iq’－ AGrp检测，同时与血凝抑制试验结果相对比，二者的符合率达 95％以上。基于重组地抗原的 AGIP可用于检测SIV感染，而rPRVHA疫苗免疫的动物不会产生抗NP蛋白的抗体，因此，也可用于SIV自然感染和重组疫苗免疫的鉴别诊断。 根据重组伪狂犬病毒载体疫苗缺失gE基因的特性，利用 PCR技术扩增了 gE基因除信号肽和跨膜区外所有反应区域的核苦酸序列，并将其定向亚克隆于pGEX七P4中，获得重组表达载体pGEXgE。经SDS－PAGE、Westeth七＊分析证实表达的重组蛋白具有良好的抗原反应活性。将表达产物利用亲和层析法纯化，制备抗原建立了ELISA诊断方法。通过对ELISA特异性、敏感性及工作条件的优化试验，确立了反应的最佳程序。统计学分析48份阴性血清的检测结果，得出判定标准。利用所建立的 gEELISA方法对 400余份送检血清样品检测，结果证明该方法特异性强、敏感性高、重复性好，与国外竟争 gEELISA相符率在 93％以上。 总之，本试验获得了表达 H3 亚型 SIV HA基因的重组伪狂犬病毒（呈gE＊KAs”LacZ十表型人并分别建立了可以特异性地检测SIV和PRV野毒感染的鉴别诊断方法，这将对清流感和伪狂犬病的综合防制及根除具有重要意义。